1)脊髓内LPS局部注射以时间依赖的方式诱导脊髓中ICAM-1的表达,其在炎症的早期上调,而后逐渐恢复正常。 没有 2)在正常脊髓中ICAM-1表达很少被检测出。在给予LPS注射后,注射侧脊髓中ICAM-1阳性信号明显增多,其主要分布在注射侧的脊髓灰质前角和后角的小胶质细胞中,而在白质及对侧的脊髓中分布较少。

3)在LPS脊髓内注射后,ICAM-1的配体LFA-1、Mac-1的蛋白表达增高,但是Mac-1的表达增高迟于LFA-1的变化 [结论] 1.正常状态下,ICAM-1在坐骨神经、DRG及脊髓中分布较少。损伤及LPS等炎性应激后该分子反应性表达增高,提示该分子作为一种炎症反应蛋白,参与神经系统早期的炎症反应。 2.在周围神经系统中,损伤及炎性因子刺激后,高表达的ICAM-1主要定位于施万细胞,这提示该分子可能参与炎症介导的施万细胞的生物学行为的改变。 3. LPS以时间和剂量依赖的方式诱导施万细胞中ICAM-1表达,该作用主要依赖于LPS可诱导的MAPK通路中p38和SAPK/JNK通路的激活。 4.在脊髓中,炎症因子可显著诱导小胶质细胞内ICAM-1的表达,提示ICAM-1可能作为一种炎症反应蛋白,参与小胶质细胞的活化。 5.在LPS注射的脊髓中,ICAM-1的配体LFA-1、Mac-1的蛋白表达增高,提示ICAM-1可能通过与配体间的相互作用来影响小胶质细胞的活化。
背景及目的 胶质瘤是颅内最常见的原发性恶性肿瘤,约占成人中枢神经系统肿瘤的50%-60%,成人中发病率为每年8/10万,胶质瘤患者的预后不佳。由于胶质瘤恶性度高,呈侵袭性生长,导致手术难以全切,术后复发率、死亡率较高。 胶质瘤的发生与体内多种癌基因和抑癌基因异常有关,但胶质瘤中相关癌基因和抑癌基因的变化还没有完全清楚,癌基因和抑癌基因之间的复杂关系需要进一步阐明。 第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物(Phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten, PTEN)是近年发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因,在调节细胞的增殖、迁移、粘附等方面发挥重要作用。 丝裂原活化蛋白激酶(]mitogen-aetivatedproteinkinase, MAPK)参与细胞的生长、发育、分裂、凋亡,以及细胞间的功能同步等多种过程。 本实验的目的是研究PTEN与p38MAPK在人脑胶质瘤瘤中的表达情况,与胶质瘤病理级别之间的关系及其相关性,从而进一步阐明胶质细胞瘤侵袭性的分子机制,为其诊疗提供理论依据。 方法 研究对象为郑州大学第一附属医院神经外科2008年5月至2010年10月期间的胶质瘤手术切除且保存完好的石蜡包埋标本64例,其中男性33例,女性31例,患者年龄9-82岁,平均45.5岁。组织学分级根据2000年修改的WHO神经系统肿瘤分级标准对其进行组织学的分类分级,其中Ⅰ级22例,Ⅱ级21例,Ⅲ级13例,Ⅳ级8例。其中把Ⅰ级和Ⅱ级胶质瘤合并为低级别度恶性组,把Ⅲ和Ⅳ级胶质瘤级合并为高级别度恶性组,另取10例脑外伤患者的正常脑组织做为对照组。采用免疫组化(S-P法streptavidin-peroxidase链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶法)分别对低级别度恶性组和高级别度恶性组以及和正常脑组织组中的PTEN和p38MAPK的表达进行进行测定。最后用χ2检验及Fisher精确概率法来计算正常脑组织组与低级别度恶性组、低级别度恶性组与高级别度恶性组之间的差异,再以Spearman等级相关分析来分析PTEN与p38MAPK的相关性。

查找更多 结果 1. PTEN:随着胶质瘤病理级别的升高,PTEN蛋白的表达阳性率分别为Ⅰ级77.27%(17/22)；Ⅱ级66.67%(14/21)；Ⅲ级46.15%(6/13)；Ⅳ级37.50%(3/8)。脑胶质瘤低度恶性组阳性率为72.09%(31/43)与高度恶性组阳性率为42.85%(9/21)差异具有显著性。2.p38MAPK：随着胶质瘤病理级别的升高,p38MAPK蛋白的表达阳性率分别为Ⅰ级22.73%(5/22)；Ⅱ级39.10%(8/21)；Ⅲ级53.85%(7/13)；Ⅳ级75.00%(6/8)。脑胶质瘤低度恶性组阳性率为30.23%(13/43)与高度恶性组阳性率为61.90%(13/21)差异具有显著性。

3.脑胶质瘤组织中PTEN蛋白表达与p38MAPK蛋白表达之间有显著性差异,两者表达呈负相关。 结论 1. PTEN在正常脑组织全部表达,随着胶质瘤恶性程度的增高其阳性表达率逐渐降低,PTEN表达与胶质瘤恶性程度密切相关。 NVP-BGJ398制造商 2. p38MAPK在正常脑组织中不表达,随着胶质瘤恶性程度的增高其阳性表达率逐渐升高,p38MAPK表达与胶质瘤恶性程度密切相关。 3. PTEN和p38MAPK在人脑胶质瘤中的表达呈显著负相关性,p38MAPK在胶质瘤的发生发展中受到PTEN基因的负反馈调节。PTEN和p38MAPK可能成为临床判断胶质细胞瘤恶性程度,侵袭性及预后的有效参考指标,并可能成为胶质瘤靶向性治疗研究的新方向。
目的 小胶质细胞是中枢神经系统的固有免疫细胞,在各种神经系统疾病伴随的炎性反应中扮演着关键角色。因而研究小胶质细胞活化对神经系统炎性反应的损伤和修复有着重要的意义。实验中我们利用脂多糖激活小胶质细胞,研究其活化过程中炎性细胞因子的释放及其信号转导机制。 磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C(PC-PLC)是各种细胞中普遍存在的一种重要的酶,能特异性水解磷脂酰胆碱生成磷酸胆碱和二酯酰甘油,后者作为细胞内的第二信使,可进一步激活蛋白激酶C,进而将信号传递给丝裂原蛋白激酶,引起细胞增殖、分化和凋亡等多方面功能的改变。PC-PLC在神经系统发育和炎症反应的信号通路中具有重要作用。我们利用其特异性抑制剂D609研究PC-PLC调节小胶质细胞活化过程中的作用,为阐明PC-PLC在小胶质细胞活化过程中的作用机制提供实验证据,同时为临床上治疗神经系统疾病奠定理论基础。 研究方法 1.倒置显微镜下观察细胞形态变化 2.

01);②在角叉菜胶致炎性痛模型中,与模型组比较,OSC可抑制小鼠损伤足足肿胀的程度(P<0.01)并提高小鼠损伤足的机械缩足反射阈值(P<0.01)。2、HE染色结果显示,与模型组比较,OSC可抑制损伤足组织的水肿并减少损伤组织中中性粒细胞的数量(P0.05),但显著降低了COX-2的m-RNA表达水平(P0.05)。6、ELISA结果显示,与模型组比较,OSC显著降低了炎性痛小鼠损伤足组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2蛋白的表达(P
目的:本研究旨在观察健步通络熏蒸液对兔膝骨性关节炎关节软骨丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated AZD6244订单 protein kinases,MAPKs)信号通路中p38MAPK,c-Jun氨基末端激酶(JNK)及细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)表达的影响,探讨健步通络熏蒸液对骨关节炎关节软骨的保护作用。方法:4~6月龄新西兰大白兔26只,雌雄各半,按随机数字表法随机抽取6只作为空白组,余20只采用改良Hulth法行骨关节炎造模,术后4周随机选取2只行空气栓塞致死,取其关节软骨行HE染色,并于显微镜下观察,以验证造模是否成功,其余18只按随机数字表法随机分为模型组,熏洗组和降钙素组,分笼饲养。连续干预20天后行空气栓塞致死,取各组兔关节软骨,观察其大体形态学改变,并于显微镜下观察其病理变化,并采用PCR技术检测软骨中ERK-1/2、p38MAPK及JNK的含量的变化。结果:(1)大体形态观察:空白组关节软骨外观、颜色正常,软骨表面光滑无关节面溃疡及软骨下骨质暴露;模型组可见关节面粗糙不平,颜色偏暗,软骨缺损并可见关节边缘有大量骨赘形成;降钙素组和熏洗组,软骨表面欠光滑,个别区域颜色偏暗,可见少量骨赘。(2)HE染色:参照Mankins评分标准进行比较,模型组与空白组相比,模型组关节软骨结构、关节软骨细胞及潮线差异显著,有统计学意义(P0.05)。(3)PCR检测:与空白组相比,其余组p38、ERK1/2及JNK含量升高,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,熏洗组与降钙素组的上述指标含量均降低,差异有统计学意义(P0.05)。结论:(1)通过运用健步通络熏蒸液干预兔OA模型,发现健步通络熏蒸液可下调p38、ERK1/2及JNK含量的表达,影响OA关节软骨的病理改变,保护关节软骨,延缓OA病情的进展。(2)通过本实验中熏洗组和降钙素组两组数据的比较,发现健步通络熏蒸液和降钙素对OA有一定的治疗作用。
研究目的:正常生理情况下,力学因素对于骨及软骨细胞的形态、细胞代谢、生长分化及基质的合成与降解等方面有着重要的调节作用。而过度或不适当的应力刺激下,骨及软骨组织无法产生代偿反应,而造成微细损伤的积累,超过机体的修复能力时,导致相关疾病的发生。作为连接细胞与外界环境的重要媒介,p38MAPK细胞信号传导通路在把外界应力刺激传导至细胞内的过程中发挥着重要作用。在相关疾病的病理过程中,成骨破骨细胞的分化、炎性因子的分泌、细胞基质合成与降解的失衡及细胞凋亡增多等过程均与p38MAPK的表达增多相关。因此,本文研究跳跃应力刺激下大鼠末端病发生过程中p38MAPK含量的变化,并从理论层面试图探讨其背后的机制。研究方法:72只大约200g左右的8周龄雄性SD大鼠,购自苏州大学动物实验中心,将其随机分为对照组、实验组(跳跃组和负重跳跃组),每组24只;各组别内另随机分为2周组、4周组及6周组,每组8只。其中,负重跳跃组采用自体重5%进行负重。自制电刺激造模装置,对大鼠进行跳跃训练6周。于第二、第四及第六周试验后取材,取材部位包括跟腱、跟腱止点处软骨和骨。HE染色切片观察末端区组织的病理变化进程,并对其末端区组织的p38MAPK表达情况进行免疫组化测试,测定各个部位的阳性细胞数量。研究结果:1、末端病造模成功,据HE染色切片结果显示,造模组SD大鼠出现末端病相关病理变化,且造模后期及负重跳跃组大鼠的病理变化更为显著。2、2、4、6周对照组SD大鼠的跟腱末端区各部位的p38MAPK阳性细胞数目无显著性差异(p﹥0.05);2周跳跃组与负重跳跃组各部位的p38MAPK阳性细胞数目增加,具有显著性差异(p﹤0.01);4周跳跃组跟腱与负重跳跃组各部位的p38MAPK阳性细胞数目增加,具有显著性差异(p﹤0.01);6周跳跃组与负重跳跃组各部位的p38MAPK阳性细胞数目增加,具有显著性差异(p﹤0.01)。3、2、4、6周对照组SD大鼠的跟腱末端区各部位的p-p38MAPK阳性细胞数目无显著性差异(p﹥0.05);2周跳跃组与负重跳跃组各部位的p-p38MAPK阳性细胞数目增加,具有显著性差异(p﹤0.01);4周跳跃组跟腱与负重跳跃组各部位的p-p38MAPK阳性细胞数目增加,具有显著性差异(p﹤0.01);6周跳跃组与负重跳跃组各部位的p-p38MAPK阳性细胞数目增加,具有显著性差异(p﹤0.01)。研究结论:1、在应力刺激的作用下,大鼠末端区逐渐出现末端病病理改变。2、应力刺激可使p38MAPK及p-p38MAPK的表达增加。
目的：探讨CX3CR1在小鼠缺血性脑卒中动物模型神经元上不同时间点、不同部位的表达变化,为缺血性脑卒中的治疗提供新的思路和方法。方法：采用大脑中动脉线栓法(Middle

Gefitinib订单 LBH589浓度 Cerebral Artery Occlusion,MCAO)制备缺血性卒中动物模型,动态观察术后不同组别的小鼠症状并进行Longa评分,并于建模后06H、12H、24H、48H、72H多聚甲醛灌注取脑。采用免疫组织化学动态观察脑内不同部位、不同组别表达CX3CR1阳性细胞神经元的分布变化情况；免疫荧光方法进行细胞鉴定；观察不同组别的脑梗塞面积变化并计算梗塞面积比。结果：1、通过免疫荧光双标检验,在缺血性卒中动物模型中梗塞侧神经元上有CX3CR1的表达；2、Longa术后清醒各组平均评分为：06H组为2±1.5；12H组为2±0.5；24H组为2±0.5；48H组为2.25±0.75；72H组为1.75±0.25,组别之间无统计学意义；取标本前各组Longa平均评分为：06H组为0.5±0.

METHODS: HSCs were derived from the livers of adul male Sprague-Dawley rats. IL-6 expression was evalu ated using real-time quantitative polymerase chain reaction and enzyme linked immunosorbent

assay. The phosphorylation activity of p38 mitogen activated pro tein kinases (MAPK) and extracellular regulated pro tein kinases (ERK) 1/2 upon induction by IL-17A and suppression by IL-17RA shRNA were examined using Western blotting.RESULTS: IL-6 expression 哪里 induced by IL-17A was significantly increased compared to control in HSCs (P < 0.01 in a dose-dependent manner). Suppression of IL17RA using lentiviral-mediated shRNA inhibited IL-6 expression induced by IL-17A compared to group with only IL-17A treatment (1.44 ± 0.17 vs 4.07 ± 0.43, P < 0.01). IL-17A induced rapid phosphorylation of p38 MAPK and ERK1/2 after 5 min exposure, and showed the strongest levels of phosphorylation of p38 MAPK and ERK1/2 at 15 min in IL-17A-treated HSCs. IL-6 mRNA expression induced by IL-17A (100 ng/mL) for 3 h

exposure was inhibited by preincubation with specific inhibitors of p38 MAPK (SB-203580) and ERK1/2 (PD-98059) compared to groups without inhibitors preincubation (1.67 selleck化学 ± 0.24, 2.01 ± 0.10 vs 4.08 ± 0.59, P < 0.01). Moreover, lentiviral-mediated IL-17RA shRNA 1 inhibited IL-17A-induced IL-6 mRNA expression compared to random shRNA in HSCs (1.44 ± 0.17 vs 3.98 ± 0.68, P < 0.01). Lentiviral-mediated IL17RA shRNA 1 inhibited phosphorylation of p38 MAPK and ERK1/2 induced by 15 min IL-17A (100 ng/mL) exposure. CONCLUSION: Down-regulation of the IL-17RA receptor by shRNA decreased IL-6 expression induced by IL-17A via p38 MAPK and ERK1/2 phosphorylation in HSCs. Suppression of IL-17RA expression may be a strategy to reduce the inflammatory response induced by IL-17A in the liver.
目的探讨丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)活化与脓毒症大鼠肺组织和血浆肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达及组织炎症反应的关系。方法采用盲肠结扎穿孔术(CLP)模型制造大鼠腹腔感染。随机将56只大鼠分为正常对照组、CLP组和CLP+MAPK抑制剂(SB203580)处理组,各组又分不同时间点亚组。采用反转录多聚酶链式反应和酶联免疫吸附试验检测试剂盒分别测定血浆和肺TNF-αmRNA和蛋白水平;同时测定肺髓过氧化酶(MPO)活性、HE染色病理切片检测肺组织炎症反应程度。结果与正常大鼠相比,CLP后各时间点肺血浆和肺组织TNF-αmRNA、蛋白含量均升高明显;同时肺MPO和组织病理学评分升高明显。MAPK抑制剂处理后,与CLP组相应时间点相比,MPO和病理学评分均显著下降;TNF-αmRNA表达和蛋白含量同时显著降低。结论抑制MAPK活化可缓和脓毒症所致大鼠肺组织炎症反应,减轻肺组织损伤。
目的:研究NF-κB信号传导通路在EAE发病中的作用,观察中药复方益肾达络饮干预实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的疗效,探讨益肾达络饮治疗EAE的作用机制。方法:采用免疫蛋白质印迹法、免疫组化法测定EAE小鼠中枢神经组织中NF-κBp65、IκB-α蛋白表达的变化。结果:中药复方益肾达络饮能降低EAE的复发率(P<0.05),改善EAE模型小鼠神经功能评分(P<0.05)。与模型组相比,激素组、中药组、中药加激素组NF-κBp65表达水平明显降低,IκB-α表达水平明显升高(P<0.05)。结论:在EAE中,NF-κB介导的炎性级联反应是EAE小鼠CNS炎性浸润、轴索损伤的重要原因;中药复方益肾达络饮能降低EAE的复发率,有效改善EAE小鼠神经功能损伤;中药益肾达络饮干预EAE的作用机制与对NF-κB信号通路的调节密切相关。
为了探索丙二醛(malonaldehyde,MDA)抑制间充质干细胞(mesenchymal

那个 stem cells,MSCs)成骨分化的作用机制,用不同浓度的丙二醛孵育MSCs,进行成骨诱导培养,检测碱性磷酸酶活性和钙结节形成;并检测p38和JNK表达水平和磷酸化程度,用这两种信号分子的特异性阻断剂进行验证.结果发现,丙二醛浓度依赖性地降低MSCs碱性磷酸酶的活性,抑制钙结节的形成;并引起p38和JNK的表达上调和磷酸化增强,诱导JNK由胞浆向胞核转位;p38和JNK阻断剂对丙二醛的上述效应有拮抗作用.结果表明,丙二醛可抑制MSCs的成骨诱导分化,其作用机制涉及p38和JNK信号通路的参与.

5min时骨架便开始明显发生重组，细胞周边出现肌动蛋白聚集而形成的尾足；而在诱导5小时细胞中，细胞骨架的重组发生在HGF刺激后大约1min，在维持18h和48h阶段的细胞中，细胞骨架的重组发生在HGF刺激后大约1.5min，这说明随着分化的进行细胞骨架的重组对HGF的刺激敏感性下降。 综上，HGF能够趋化不同分化状态下BMSCs的定向迁移，PI3K/Akt和MAPKs信号通路参与介导了这些过程；成神经分化的BMSCs趋向HGF的迁移能力与其分化状态密切相关，不同的信号通路介导了不同分化状态的细胞向HGF的迁移。并且，HGF诱导的MSCs的细胞骨架的重组也与细胞的分化状态密切相关。本研究为进一步揭示BMSCs的定向迁移机制及临床应用BMSCs进行移植提供了理论基础。
研究背景

西洛他唑是1978年日本大冢制药有限公司合成的抗血小板类化合物,1988年作为治疗慢性动脉闭塞症的药物在日本上市。随着大型循证医学证实,西洛他唑可以显著改善慢性动脉闭塞症引起的下肢溃疡、疼痛、发冷和间歇性跛行等缺血性症状,1999年美国FDA批准其作为治疗稳定性间歇性跛行的药物上市。成为美国市场上第一个获得作为治疗该适应症的抗血小板聚集的药物；在临床上还被应用于治疗糖尿病等引起的外周血管性疾病。 西洛他唑是一种选择性磷酸二酯酶3抑制剂,可抑制血小板及平滑肌内磷酸二酯酶的水解,增加细胞内cAMP水平,具有抗血小板聚集及血管扩张作用。近年来还发现西洛他唑有抗炎作用及抗平滑肌细胞增殖的作用,支架植入术后应用西洛他唑可减少新生内膜的增生和重构,有抗晚期血管再狭窄的作用。这些效应将作为西洛他唑抗血小板效应的补充且使之成为缺血性疾病独特的重要治疗。 Ipatasertib 一、西洛他唑对动脉粥样硬化中血管内皮细胞的作用 动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)是常见的血管病变,是缺血性心脑血管疾病的常见原因,严重的危害着人类的健康。既往的观点认为,AS是机体脂质代谢障碍的结果,随着研究的深入,目前大多数学者认为AS是血管炎症性损伤的一种表现,认为AS是血管内皮细胞功能发生紊乱后的炎症反应及在此基础上的损伤-修复过程。血管内皮细胞(Vascular Endothelial Cells, VEC)既是血管内壁的一道机械屏障,又是一个具有高度活性的、位于血液和组织分界内表面的人体最大的内分泌器官。它具有细胞通透性、选择性屏障、止血、抗凝、纤溶、血液传输和血管活性物质代谢及调节血管运动张力、产生生长因子、纤维基质增生等作用,参与炎症反应,影响血管发生、血管通透性及液体平衡等。在动脉粥样硬化早期阶段,损伤部位活化的内皮细胞会分泌黏附分子和化学趋化因子,如血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)和单核细胞趋化蛋白(MCP-1),导致免疫细胞和单核细胞聚集并迁移到血管壁内膜。VCAM-1在早期粥样硬化斑块形成时起主要作用,并且MCP-1是慢性炎症反应的媒介,二者可使单核细胞黏附。另外,活性氧与TNF-α也参与动脉粥样硬化的形成。有研究表明细胞核因子-κB

DNA Synthesis抑制剂 (NF-κB)激活基因在人类动脉粥样硬化的血管中表达增高。 作为一种新型的磷酸二酯酶3(PDE3)抑制剂,西洛他唑的基本作用是抗血小板聚集。它有许多额外的细胞作用靶点：可抑制PDE活性和阻碍环磷酸腺昔(cAMP)降解及转化,可预防动脉粥样硬化和血栓形成及血管阻塞；减少黏附分子的表达(如VCAM-1),抑制细胞因子释放和起效(如MCP-1、PDGF和]NF-α等),具有抗炎和抗动脉抗粥样硬化的作用；此外,通过提高细胞内cAMP水平扩张血管,促进血管内皮恢复和抑制血管增生,提高组织灌注,对缺血性脑组织起神经保护作用。研究发现西洛他唑对血管内皮细胞有明显的保护作用,MATSUMOTO等的动物实验表明西洛他唑能通过增加内皮依赖性超极化因子的反应来改善2型糖尿病大鼠肠系膜动脉内皮细胞的功能。进一步的研究表明,西洛他唑可能通过ERK1/2和P38MAPK依赖途径对抗由脂多糖介导的内皮细胞凋亡。除此之外,西洛他唑还有抑制炎症细胞对内皮细胞的黏附作用及抑制内皮细胞表达的作用,MORI等发现通过上调单核细胞cAMP的浓度,西洛他唑有抑制单核细胞对内皮细胞黏附的作用。 二、西洛他唑对血管平滑肌细胞的作用血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMC)是血管壁的主要成分之一,是决定血管活性和血管构型的重要因素。其增殖在动脉粥样硬化、血管再狭窄和高血压等多种血管性疾病的形成机制中起着重要作用。在参与AS形成的细胞体系中,其中VSMC是增殖体系中最活跃的细胞。临床及实验研究均证实西洛他唑能够抑制VSMC增殖及预防冠状动脉介入治疗术后血管再狭窄。西洛他唑可以抑制由不同的生长因子,包括血小板衍生因子(PDGF)胰岛素和胰岛素样生长因子-1诱导的体外培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞的增殖反应,也可抑制由PI3GF诱导的体外培养的人血管平滑肌细胞的增殖反应。近年来的研究还显示,血浆PAI-1的水平与冠心病、内膜增生和再狭窄密切相关,而西洛他哗能通过各种机制包括下调TGF-B,

MEK pathway JNK和P38信号途径,抑制相关细胞因子的表达,从而起到抗血管平滑肌细胞增殖的作用。 三、西洛他唑对丝裂原活化蛋白激酶的作用 丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)家族属于高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,广泛分布于真核生物胞浆中。MAPK信号通路是一条细胞外信号引发细胞核内反应的重要途径,在细胞形成、分化、生长、增殖及凋亡过程中发挥着重要作用。目前发现MAPK家族有四条信号通路：即细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)、c-Jun N端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)、p38MAPK和ERK5/BMK1通路。经典的MAPK级联反包括3个激活步骤MAPK激酶激酶(mitogen-activated protein kinase ki-nase kinase, MAPKKK)激活后磷酸化并激活MAPK激酶(mitogen-activated protein kinase kinase, MAP-KK),接着MAPKK通过双重磷酸化邻近的苏氨酸和酪氨酸而激活MAPK,激活后的MAPK可由胞浆转运至细胞核内作用于靶目标。大量事实表明MAPK也是西洛他唑的作用靶点。 研究目的 西洛他唑目前在临床上广泛应用于血管性疾病包括缺血性心脑血管疾病的一级和二级预防,也是抗血小板药物治疗的基础。已有大量临床研究证实,西洛他唑可减少与动脉粥样硬化有关疾病的发生。血管内皮细胞功能障碍和血管平滑肌细胞增殖在动脉粥样硬化发生发展中起重要作用。本研究旨在分别观察西洛他唑对体外培养的血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的增殖及磷酸化P38MAPK丝裂原活化蛋白激酶表达的影响,以进一步从细胞和分子水平上阐述西洛他唑对动脉粥样硬化血管的保护作用。 研究方法 1.

干预HSC的研究主要有:干扰细胞信号转导通路,抑制炎症反应,对抗氧化应激,调节相关细胞因子活性等.本文综述了P38 MAPK信号通路的主要功能、常见研究方法及对肝纤维的作用机制,以期为实验研究提供思路.
目的:二烯丙基二硫(DADS)为天然植物大蒜中的提取物,能抑制多种肿瘤细胞生长,本文探讨丝裂原激活的蛋白激酶(MAPKs)、3-磷酸肌醇激酶(PI3K/Akt)信号通路和Bcl-2家族成员在DADS诱导的人白血病HL-60细胞凋亡中的作用。方法:利用流式细胞术检测DADS诱导的白血病细胞凋亡,Western blot研究MAPKs和PI3K/Akt信号通路在DADS诱导的人白血病HL-60细胞凋亡中的变化及对Bcl-2家族凋亡相关蛋白表达的影响。结果:DADS呈浓度和时间依赖性地诱导人白血病HL-60细胞凋亡,在此过程中ERK/MAPK和PI3K/Akt信号通路被抑制,而p38MAPK信号通路被激活,ERK/MAPK和PI3K/Akt信号通路通过降低Mcl-1(myeloid

cell leukemia-1)和升高Bax的表达诱导人白血病细胞凋亡,而p38MAPK则不是通过调控Mcl-1和Bax的表达诱导人白血病细胞凋亡,进一步利用RNA干扰技术沉默Mcl-1基因可增加DADS对HL-60细胞增殖抑制和诱导凋亡作用。结论:MAPK和PI3K/Akt信号通路通过下调Mcl-1的表达参与了DADS诱导的HL-60细胞凋亡作用。
目的探讨不规则趋化因子(FKN)在动脉粥样硬化形成中的作用及其可能的信号转导途径,以及FKN影响人单个核细胞表达NFκB过程与Ras/p38丝裂原活化蛋白激酶信号传导通路的相关性。方法采用密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞,将细胞预处理后分为:空白1组、FKN 1组、FKN+Ras抑制剂组(FTI-277组)、空白2组、FKN 2组、FKN|p38抑制剂组(SB203580组)。分别于30 不 min时,采用Western blot方法对磷酸化p38及NF-κB进行半定量测定。结果与空白1组、空白2组比较,FKN 1组、FKN 2组NF-κB和p38相对吸光度值明显增加(P
mTOR是处于调节细胞代谢、生长、增殖等整个过程中心环节的重要激酶。干扰或抑制mTOR会引起细胞尤其是癌细胞的生长停滞继而死亡,因而也被公认为是癌症治疗当中的一个潜在靶标。一系列的mTOR抑制剂Rapamycin及类似物已经形成并在临床抗肿瘤中有所应用,但其展示的效应非常有限。随着研究的深入,发现mTOR信号通路存在反馈激活机制:即抑制mTOR能反馈性激活多个与细胞生长增殖相关的信号通路。并且认为是这些反馈激活机制削弱了mTOR抑制剂的效能,也是其临床效应未达预期的原因。本文就目前国内外研究较深入的mTOR-AKT,mTOR-ERK,mTOR-eIF4E反馈信号通路做详细概述,并阐述目前采取的防止这一反馈机制形成的Rapamycin类似物与特定通路抑制剂的联合用药策略,使mTOR抑制剂在临床抗肿瘤中能充分发挥其效能。
p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号途径是成肌细胞分化过程中重要的调节途径。p38

M APK蛋白在成肌细胞分化过程中受上游丝裂原活化蛋白激酶激酶3(M KK3)、丝裂原活化蛋白激酶激酶6(MKK6)的激活而活化其下游成肌分化蛋白(MyoD)、肌生成素5(Myf5)、肌形成蛋白(myogenin)、肌肉调节因子4(MRF4)等肌肉调节因子。p38 MAPK信号途径的活化可以进一步增加骨骼肌纤维细胞蛋白含量,增加肌纤维长度和横截面直径,使骨骼肌纤维在数量不变的前提下质量大幅度提高,本文就p38 BMS-907351化学结构 Z-VAD-FMK制造商 MAPK信号途径调节骨骼肌生长发育的机理进行综述。
AIM:To

examine how high-mobility group box 1 (HMGB1) regulates hepatocyte apoptosis and,furthermore,to determine whether glycyrrhizin (GL),a known HMGB1 inhibitor,prevents HMGB1-induced hepatocyte apoptosis.METHODS:A human hepatocellular carcinoma cell line stably transfected with a bile acid transporter (HuhBAT cells),were used in this study.Apoptosis was quantified using 4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride staining and the APO Percentage apoptosis assay,and its signaling cascades were explored by immunoblot analysis.Kinase signaling was evaluated by immunoblotting and by using selective inhibitors.It is also tried to identify hepatocyte apoptosis affected by the HMGB1 inhibitor,GL.RESULTS:HMGB1 increased cellular apoptosis in HuhBAT cells.HMGB1 led to increased cytochrome c release from mitochondria into the cytosol,and induced the cleavage of procaspase 3.However,it did not affect the activation of caspase 8.HMGB1-induced caspase 3 activation was significantly attenuated by the p38 inhibitor SB203580.GL significantly attenuated HMGB1-induced hepatocyte apoptosis.GL also prevented HMGB1-induced cytochrome c release and p38 activation in Huh-BAT cells.

0软件设计PLGF、GAPDH两者的引物和Taqman探针 (2)利用Trizol试剂提取细胞总RNA (3)重组质粒pUCmT-PLGF的构建 (4)重组质粒pUCmT-GAPDH的构建 (5)real-time PCR检测人肺癌细胞系中PLGF的mRNA表达水平 二、PLGF沉默对小细胞肺癌细胞穿过血脑屏障的作用的研究 1、以腺病毒为载体的RNAi载体的构建 (1)含目的基因(siPLGF)的穿梭子(shuttle)构建 ①构建双链siPLGF：双链短发夹oligo DNA退火连接 ②线性化shuttle空载体与双链siPLGF的连接 ③重组质粒的转化、筛选和鉴定 (2)腺病毒的重组 ①线性化载体shuttle(si PLGF) ②shuttle和pAdEasy腺病毒载体共转化细菌BJ5183 ③重组子的筛选和鉴定 ④重组子(Ad-shuttle-siPLGF)的大量扩增 2、病毒颗粒的包装 (1) HEK293细胞的培养 (2)初级病毒颗粒的形成

(3)二级病毒颗粒的形成 (4)三级病毒颗粒的形成 (5)病毒颗粒滴度的测定 3、NCI-H250细胞的感染及沉默功能的鉴定 (1) NCI-H 250细胞的感染 (2) real-time PCR方法鉴定RNA干扰效果 4、具有PLGF沉默效应的NCI-H250细胞功能鉴定

(1)荧光定量方法检测有、无PLGF沉默效应的NCI-H250细胞穿过HBMEC单层的情况 还有 (2)检测有、无PLGF沉默效应的NCI-H250细胞对体外血脑屏障模型跨膜电阻抗(TEER)的影响 5-FU数据表 (3)检测有、无PLGF沉默效应的NCI-H250细胞对体外血脑屏障模型通透性的影响：HRP通过率分析 (4)免疫荧光法观察有、无PLGF沉默效应的NCI-H250细胞穿过HBMEC单层时对紧密连接结构蛋白ZO-1的影响 三、PLGF改变脑微血管内皮细胞间紧密连接的分子机制的研究 1、检测PLGF重组蛋白对体外培养的HBMEC单层渗透性的影响 (1) Trailswell体外血脑屏障模型的建立 (2)检测PLGF对体外血脑屏障模型跨膜电阻抗(TEER)的影响 (3)检测PLGF对辣根过氧化物酶(Horse-radish peroxidase，HRP)穿过率的影响 2、观察PLGF重组蛋白对HBMEC间紧密连接结构的影响 (1)免疫荧光法观察PLGF对体外培养的HBMEC间紧密连接(tightjunction，TJ)结构蛋白ZO-1的影响 (2) Westem blot方法检测PLGF对体外培养的HBMEC间紧密连接结构蛋白occludin的影响 3、观察PLGF重组蛋白对Rho酪氨酸激酶活化的影响 (1)观察ROCK，Rho，PI3K，PKC，ERK抑制剂作用下，PLGF对HBMEC的诱导作用 (2) Pull-down方法检测Rho酪氨酸激酶的活化情况 (3) Westernblot方法检测cofilin的变化情况 4、免疫荧光法观察HBMEC细胞骨架微丝的变化

结果 一、PLGF在肺癌中的表达 1、免疫组织化学方法检测PLGF在肺癌组织标本中的表达 (1)对72例SCLC、45例人肺腺癌、24例人肺鳞癌和5例癌旁组织标本进行免疫组织化学染色，结果显示，在小细胞肺癌、肿鳞癌和肺腺癌中均有PLGF阳性细胞表达。 (2)对免疫组织化学染色结果进行灰度扫描，对Integrated OD Average值做t-检验，PLGF在肺腺癌中高表达；在SCLC和肺鳞癌中表达略低于肺腺癌。 (3)在72例SCLC中，有20例(27.8％)PLGF高表达，52例(72.2％)PLGF低表达；对PLGF高达表组和PLGF低表达组患者淋巴结转移数目进行比较，p＜0.05，存在统计学意义。 2、RT-qPCR检测肺癌细胞系中PLGF mRNA的表达情况 六株组织学不同、来源不同的肺癌细胞系中，PLGF 3-deazaneplanocin A mRNA表达水平不同：NCI-H 250细胞(来源于SCLC脑转移灶的细胞株)PLGF高表达；NCI-H 209细胞(来源于SCLC骨髓转移灶的细胞株)PLGF表达略低；NCI-H 446(来源于SCLC胸水渗漏的细胞株)PLGF低表达；A549(肺腺癌细胞系)和BE1、LH7(大细胞肺癌)PLGF也呈低表达。 二、PLGF沉默对小细胞肺癌细胞穿过血脑屏障的作用的研究 1、以腺病毒为载体的RNAi系统的构建 成功构建了携带短发夹siPLGF的穿梭载体：shuttle(siPLGF)，并与腺病毒骨架载体成功重组，获得了六个腺病毒RNAi重组子(Ad-shuttle-siPLGF)。 2、完成HEK293细胞三次病毒包装并获得了纯化病毒颗粒，含量为1.5×10~11virus。 3、AD-shuttle-si PLGF感染NCI-H 250细胞 (1)利用携带si-PLGF腺病毒颗粒感染NCI-H250细胞，感染率可达80％。 (2)利用RT-qPCR检测感染病毒颗粒的NCI-H250，Ad-shuttle-si PLGF细胞与Ad-shuttle-scramble组细胞相比，PLGF mRNA表达明显降低，并存在统计学意义(p＜0.

05),ZT/F2(2F2)也无抑制集落形成的效应(p>0.05)。 (3)检测Raji细胞凋亡发现,ZT/F2(2F2)抗体处理组和MSP+ZT/F2(2F2)抗体处理组作用72小时,早期凋亡比例比空白对照组升高(p
肾移植后随着新型针对T细胞强效免疫抑制剂的广泛联合应用，使急性细胞性排斥反应得到了很好的控制，也大大减少了早期移植肾的丢失。然而，近年研究表明移植肾长期存活并没有随之得到很好改善，这使人们开始重视HLA（Human selleck化学 leukocyteantigen，HLA）抗体介导的急、慢性体液性排斥反应对移植肾长期存活的意义。尽管在抗体介导排斥反应中，多数情况是由于HLA抗体的缘故，但在一些HLA抗体阴性的患者中也发生了肾移植失功，这表明除HLA抗体外还存在其它抗体也介导移植肾失功。 主要组织相容性复合物-Ⅰ类相关链A（Major histocompatibility complex classI–related chain A，MICA）基因位于人第6号染色体的MHC-I类区域中，具有高度多态性，其编码MICA分子表达在内皮细胞表面。功能上MICA分子不结合β2微球蛋白，缺乏与CD8受体特定结合的残基，没有抗原肽递呈能力；其系通过与NKG2D（Naturalkilling

cells receptor G2D，NKG2D）受体结合实现生物学功能。NKG2D是为NK细胞活化性受体，除表达于NK细胞外，还表达在γδT、CD8+T细胞上。MICA分子与NKG2D结合后不仅能激活NK细胞和T细胞毒性作用，分泌大量细胞因子及细胞毒介质，造成移植物破坏；而且能促使B细胞产生相应MICA抗体，参与体液免疫应答。 由于MICA分子通常不表达在淋巴细胞表面，在肾移植时通常采用的淋巴细胞交叉反应无法检测到MICA抗体。近年随着MICA抗体检测技术的进步，多个器官移植中心在移植受者、排斥反应前、发生排斥反应切除的移植物中及其洗脱液中都检测到MICA抗体，使MICA抗体的体液免疫作用备受关注，成为移植免疫研究的热点。一系列研究表明，MICA抗体与排斥反应相关，对移植物的长期存活存在负面效应，这种负面效应在HLA良好配型无或少量HLA抗体的受体中更为明显。虽然有研究认为MICA抗体可以通过补体依赖的细胞毒途径造成内皮细胞损伤，引起移植物失功；但对MICA抗体引起急、慢性排斥反应的确切分子免疫作用机制及系统干预措施目前仍不十分清楚，也缺乏特异性MICA抗体介导的体液性排斥反应动物模型相关方面研究。 因此，我们设想采用蛋白重组技术制备具有免疫活性的重组MICA08蛋白免疫大鼠，建立预存特异性MICA抗体动物模型。通过对预存特异性MICA抗体动物进行肾移植诱导建立特异性MICA抗体介导的排斥反应并观察其对大鼠移植肾的影响，探讨新型免疫剂利妥昔单抗在干预MICA抗体介导的排斥反应中的价值。研究分三个部分： 第一部分：应用昆虫-杆状病毒表达系统制备重组MICA08蛋白 目的：应用昆虫-杆状病毒表达系统在昆虫细胞(Sf-9)中表达人MICA﹡008胞外结构域。 方法：采用昆虫-杆状病毒表达系统，构建重组转移载体pFastBac-MICA﹡008，并将其转化到E.

coliDH10Bac感受态细胞中进行转座，通过蓝白斑筛选和测序鉴定后，获得重组杆状病毒Bacmid-MICA﹡008；应用脂质体转染Sf9细胞进行目的蛋白表达，并对表达产物进行镍柱亲和层析纯化、Western blot和考马斯亮兰染色鉴定。结果：在重组病毒感染第四天后收集P3代病毒上清液，P3代上清液经镍柱亲和层析纯化，最后获得纯化重组MICA08蛋白量约为1.4-1.5mg/L。纯化MICA08蛋白经Westernblot和考马斯亮蓝染色鉴定，可见一条分子量约为37kDa的特异性条带与目的蛋白大小相符。 因为 selleck化学药品液面控制 结论：应用昆虫-杆状病毒表达系统可在昆虫细胞中成功表达重组人MICA08蛋白，为下步预存抗体模型的建立奠定了物质基础。 第二部分显微外科微血管吻合技能训练及大鼠原位肾移植模型建立目的：探讨快速建立大鼠原位肾移植模型的显微外科训练方法，为开展肾移植基础研究奠定基础。 方法：设计并实施循序渐进式显微外科训练项目，以快速突破微血管吻合技术瓶颈。训练项目包括镜下纱布缝合、大鼠颈动脉吻合、大鼠股血管吻合及大鼠尾动脉吻合训练。然后采用30例同系SD大鼠供体双肾切除原位移植训练积累手术经验，克服学习曲线；术中肾血管重建采用端-端吻合法，尿路重建运用膀胱瓣技术或输尿管-输尿管端端吻合。模型稳定后，再行20例SD→Wistar大鼠异系移植建立急性排斥反应模型，并将其随机分排斥组和MMF治疗组，MMF治疗组给予MMF20mg/kg/d灌胃，×10d。在术后第3d、7d、14d、21d采血，行血清肌酐检测。结果：通过2个月强化显微外科培训，完成了200根以上微血管吻合练习，大鼠肾移植模型趋于稳定，术后一周成活率达90%。在行20例异系移植中，平均手术时间为72.9±4.18min，平均热缺血时间为25.4±1.63min。排斥组大鼠BCr在术后第三天开始升高，而MMF组在术后14天开始升高；两组分别于术后第7天和术后21天达顶峰，与同系组相比差异均有显著统计学意义（P
慢性、难愈性创面和溃疡是现代医学面临的一个重要难题，尤其是老年患者和糖尿病患者，其创面愈合更加困难。成体干细胞具有自我更新能力和分化能力，在维持组织稳态、促进创面修复和组织再生方面发挥着重要作用。皮肤创面修复需要表皮干细胞向创面中心定向迁移。指导表皮干细胞向创面中心迁移可能为促进皮肤创面愈合提供新的方法。皮肤创面存在内源性生物电场，其中心为负极。但是，创面生物电场能否调节表皮干细胞生物学行为目前尚不明确。

新血管生长，即血管生成，在创面修复中发挥着必不可少的作用。内皮祖细胞的迁移对于新血管的生成至关重要。指导内皮祖细胞定向迁移对于促进血管损伤修复和创面愈合可能具有显著临床意义。因此，本研究观察了生物电场对体外培养的人内皮祖细胞生物学行为的影响。 皮肤创面的再上皮化依赖于成片表皮细胞向创面中心迁移。然而，针对表皮细胞迁移的研究多集中在单细胞上，对于成片细胞迁移的研究相对较少，其机理尚不清楚。体外培养的成片细胞通常无自发性定向运动，阻碍了对其迁移机理的研究。因此，在本研究中我们应用生物电场刺激诱导成片表皮细胞定向迁移并进而探讨其迁移的机理。 在本研究中，我们首先观察了调节内源性生物电场的强度对皮肤创面愈合速度的影响。随后我们分离、培养、鉴定了表皮干细胞和内皮祖细胞，并观察了两种干细胞的趋电性。最后我们观察了电场对成片表皮细胞定向迁移的诱导作用并在其迁移机理方面取得了一些新的发现。 本研究的主要发现如下： 1.大鼠皮肤创面存在显著的外向性电流，且增强该电流可促进创面愈合的速度； 2.体外培养的表皮干细胞具有显著的趋电性，而细胞骨架蛋白F-actin在胞内的不对称分布发挥着重要作用； 3.

Ang-(1-7)能有效抑制AngⅡ对VSMCs增殖和迁移的促进作用。 2.AngⅡ能有效激活ERK1／2、P38、JNK1／2,抑制SM22α表达。Ang-(1-7)能够下调AngⅡ引起的ERK1／2、P38激活,增加SM22α表达,A779可大部分逆转Ang-(1-7)的作用。Ang-(1-7)对JNK1／2的激活无显著作用。 3. Ang-(1-7)-MAS-ERK/P38-SM22α可能是影响VSMCs生物活性的主要信号通路。 1.背景 动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是导致心脑血管疾病的病理学基础。肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)在血管平滑肌细胞(vascular somooth muscle cells,VSMCs)增殖、迁移及AS斑块形成和进展过程中起着重要的作用。血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,

更多 AngⅡ)是RAS系统的主要活性成分。大量的研究证实,AngⅡ可显著促进VSMCs的增殖和迁移活性,促进AS形成和进展。 血管紧张素-(1-7)[Angiotensin-(1-7), Ang-(1-7)]是近年来发现的RAS家族新成员,在体内主要由血管紧张素转化酶-2(angiotensin converting enzyme-2,ACE2)分解AngⅡ所产生。近年研究发现,Ang-(1-7)是AngⅡ重要的内源性拮抗剂,具有抑制炎症和氧化应激、激活磷酸酯酶、促进肾脏排钠、促进血管舒张等作用,介导了心肌重构和纤维化、高血压血管重构、血管平滑肌细胞增殖、炎症、血管内皮细胞功能调节等多个病理生理过程。 以往研究发现,Ang-(1-7)可抑制球囊内皮损伤模型中主动脉VSMCs增殖和迁移以及血管内膜增厚。本实验室的研究也发现,ACE2过表达可抑制早期AS病变的形成。这些研究提示,Ang-(1-7)在AS的进程中可能发挥着重要的保护作用。因此,通过直接应用Ang-(1-7),拮抗体内AS进程中过度激活的AngⅡ,对AS病变得预防和治疗可能起到有益的作用。然而,Ang-(1-7)对于AS病变形成的量效关系至今不明。此外,我们的体外研究证实,Ang-(1-7)可调节VSMCs的ERK1／2、P38、SM22α等信号蛋白的表达,抑制VSMCs的增殖和迁移,但这些体外实验的结果能否在体内得到验证尚不明了。

无 因此,本研究提出如下假设：在ApoE-／-小鼠AS病变模型中,Ang-(1-7)可通过调节体内MAS-ERK/P38-SM22α信号转导通路,抑制VSMCs增殖和迁移,进而抑制AS的发展。 2.目的 2.1在体内试验中,观察不同剂量的Ang-(1-7)对ApoE-／-小鼠AS病变的抑制作用； 2.2在体内实验中,验证Ang-(1-7)抑制ApoE-／-小鼠AS病变形成的机制。 3.方法 3.1 ApoE-／-小鼠AS模型的建立 8周龄的雄性ApoE-／-小鼠实验全程高脂饮食(含0.25%胆固醇和15%脂肪)喂养8周。 Pazopanib小白鼠 3.2 Ang-(1-7)体内干预实验 高脂喂养4周后,随机分为PBS对照组(12只)、Ang-(1-7)干预组(36只)和A779干预组(36只)。Ang-(1-7)和A779组又分别分为3个剂量组(100ng／kg.min、200ng／kg.min、400ng／kg.min)。用药具体方法为：经植入式胶囊渗透压泵皮下持续泵入,用药28天。 分别于药物干预4周后处死动物,进行斑块的病理学和免疫组织化学检测。 3.3血液生化指标检测 分别检测血清甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇的水平。 3.4组织病理学检测 将主动脉纵剖后行大体油红O染色,对主动脉根部斑块进行H&E染色,心肌组织进行Masson染色；并通过免疫组织化学方法检测主动脉SM22α和肾脏内MOMA-2的表达。 3.5 Western blot检测 取新鲜主动脉根部组织,提取蛋白质,Western blot检测AS病变组织p-ERK1／2和p-P38的表达。 4.结果 4.1血液生化指标检测： 对照组、Ang-(1-7)各亚组和A779各亚组血清TC、TG、HDL-C、LDL-C未见统计学差异。 4.2 Ang-(1-7)的抗AS作用 大体油红O染色显示,与对照组相比,各Ang-(1-7)干预组均能有效抑制主动脉表面AS病灶范围。Ang-(1-7)抑制主动脉表面AS病变的作用呈剂量依赖性；随Ang-(1-7)浓度的增加,主动脉表面AS病灶范围逐渐减少。Ang-(1-7)最大剂量组与对照组主动脉表面AS病灶范围有显著统计学差异(2.58% vs.4.14%,P<0.05)和主动脉根部(23.22%vs.20.28%,P0.05),但均显著低于对照组(P值均0.

探讨炎症抑制胰岛素信号传导而导致MS心肌重构的机制。 5.探讨黄连解毒汤对MS大鼠心肌重构干预作用的可能机制,为临床干预MS导致的心肌重构提供新的治疗靶点。 方法 雄性Wistar大鼠45只,随机分为两组:正常对照组(NC组,n=10),模型组(n=35)。NC组给予标准大鼠饲料及普通饮水喂养,模型组给予高糖、高脂及高盐饲料及20%高蔗糖水喂养(HF饮食)。HF饮食喂养16周后,将成模的21只大鼠随机分为代谢综合征组(MS组,n=10)及黄连解毒汤组(HLJDT组,n=11)。此后12周,MS组继续给予HF饮食同时每天以生理盐水2ml灌胃;HLJDT组继续给予HF饮食同时每天以黄连解毒汤1.04g/100g灌胃;NC组继续给予标准大鼠饲料及普通饮水喂养同时每天以生理盐水2ml灌胃。

实验过程中,进行以下检测:(1)整个实验过程中,每2周称量体重及测尾动脉血压1次;(2)分别于造模前、HF饮食喂养16周、实验末抽取静脉血测定空腹血糖、空腹胰岛素、血脂(甘油三酯,胆固醇,高、低密度脂蛋白),并计算胰岛素抵抗指数(IRI);(3)实验末抽取静脉血测定血清IL-6及TNF-α水平;(4)分别于实验开始前、HF饮食喂养16周、实验末进行超声心动图检查。 实验结束时处死动物,留取心脏标本,进行下列检测:(1)心肌组织超微结构和病理学检查;(2)应用Masson染色进行心肌组织间质胶原定量;(3)TUNEL法检测心肌细胞凋亡;(4)免疫组织化学检测MCP-1、ICAM.1及NF-κB P65、P50;(5)实时定量RT-PCR法检测CollagenⅠ/Ⅲ、TGF-p、ICAM-1、IL-6、TNF-α、IKKβ及NF-κB等mRNA的表达;(6)Western Blot法检测Ivd3、NF-κB、JNK、IRS-1及Akt等蛋白表达。 结果 1.大鼠代谢指标比较 实验开始时NC组与模型组两组大鼠代谢指标比较:体重(BW)、尾动脉收缩压(SBP)、空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)、胰岛素抵抗指数(IRI)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)等指标均无统计学差异(P＞0.05)。 BAY 73-4506 Doxorubicin 花费 HF饮食喂养16周后NC组与模型组两组大鼠代谢指标比较:与NC组比较,模型组大鼠BW、SBP、TC、FINS、FBG及IRI升高(P＜0.01),HDL-C降低(P＜0.01)。 药物干预12周后NC、MS及HLJDT三组大鼠代谢指标比较:与NC组比较,MS组大鼠BW、SBP、TC、FINS、FBG及IRI进一步升高(P＜0.01);与MS组比较,HLJDT组大鼠BW、SBP、FINS、FBG及IRI降低(P＜0.01～0.05),HDL-C有所升高(P＜0.05)。 2.血清ELISA检测 药物干预12周后三组大鼠血清IL-6及TNF-α水平比较:与NC组比较,MS组大鼠IL-6及TNF-α表达升高(P＜0.01);与MS组比较,HLJDT组大鼠IL-6及TNF-α表达降低(P＜0.01)。

3.超声心动图检测 常规超声心动图指标情况:实验开始时NC组与模型组两组大鼠左室舒张、收缩末期内径(LVEDd、LVEDs)、舒张末期室间隔厚度(IVS)及左室后壁厚度(LVPW)、相对室壁厚度(RWT)、左室相对质量(LVRW)、左室短轴缩短率(FS)、舒张早期与舒张晚期峰值速度比值(E/A)及E峰减速时间(DT)均无差异(P＞0.05)。HF饮食喂养16周后,与NC组比较,模型组IVS、LVPW、RWT及LVRW明显增加(P＜0.01),E/A比值明显减小(P＜0.01),DT时间延长但差异无统计学意义(P＞0.05)。药物干预12周后,与NC组比较,MS组IVS、LVPW、RWT及LVRW均明显增加(P＜0.01),E/A比值明显减小(P＜0.01),DT延长(P＜0.05);与MS组比较,HLJDT组IVS、LVPW、RWT及LVRW均明显减小(P＜0.01),E/A比值明显升高(P＜0.05),DT有所缩短但无显著性差异(P＞0.05)。 ABT263 IBS指标情况:实验开始时两组大鼠IVS、LVPW的心肌校正IBS(IBS%)及背向散射积分周期变化幅度(CVIB)均无差异。HF饮食喂养16周后,与NC组比较,模型组IVS、LVPW的IBS%明显升高(P＜0.01),CVIB明显降低(P＜0.01)。药物干预12周后,与NC组比较,Ms组IVS、LVPW的IBS%明显升高(P＜0.01),CVIB明显降低(P＜0.01);与MS组比较,HLJDT组IVS、LVPW的IBS%明显降低(P＜0.05),CVIB明显升高(P＜0.05)。

4.透射电镜检测 NC组左室心肌组织细胞排列整齐,心肌细胞质膜连续、完整;粗细肌丝排列整齐,肌小节及明暗各带清晰可见;线粒体丰富、大小均一、圆形或椭圆形;核膜光滑完整,异染色质成簇状聚集在核周部;闰盘清晰、连续,结构完整;细胞间质可见成纤维细胞和少量胶原纤维;微血管管腔大小正常,内皮细胞结构正常。MS组左室心肌组织细胞部分肌节宽窄不一,有的肌节Z带、I带特征性结构变浅或消失,肌丝排列紊乱,质膜模糊、断裂;一些心肌细胞肌原纤维呈灶性溶解,有残存的膜结构和散乱的线粒体;线粒体明显增多,呈堆积状,肿胀、可见指纹状线粒体;核形状极不规则,多见深的切迹,常染色质呈团块状聚集;闰盘扭曲模糊断裂;微血管管腔狭窄,内皮细胞肿胀明显,呈柱状向管腔突起。HLJDT组左室心肌组织总体较MS组明显好转,细胞排列较整齐;肌原纤维断裂、溶解现象好转,可见T管系统略有扩张;线粒体大小较一致,排列较规整,未见指纹状线粒体;核形状较MS组规则,闰盘基本连续,间质内胶原堆积明显好转,微血管腔内皮细胞肿胀好转。 5.组织病理检测 HE染色显示,NC组心肌细胞排列整齐,细胞核大小均一,胞浆染色均匀;MS组心肌细胞排列紊乱,细胞核大小不甚规则,可见肌纤维断裂、排列紊乱;HLJDT组较MS组明显好转,心肌细胞排列较规整,肌纤维断裂少见,细胞核较规则。 6.Masson染色胶原含量检测 Masson染色显示胶原纤维呈蓝绿色,心肌纤维呈红色或黄色。NC组胶原组织分布均匀,排列整齐;MS组心肌间质胶原纤维明显增多,围绕心肌细胞的胶原纤维断裂、排列紊乱;HLJDT组较MS组心肌间质胶原纤维明显减少,相邻细胞的胶原纤维排列整齐。 定量分析显示:与NC组比较,MS组左室心肌组织胶原含量明显升高(P＜0.01);与MS组比较,HLJDT组左室心肌组织胶原含量明显降低(P＜0.05)。 7.TUNEL检测 TUNEL染色阳性细胞为细胞核呈棕褐色或棕黄色颗粒。NC组大鼠心肌细胞中可见极少量TUNEL染色阳性细胞。定量分析显示:与NC组比较,MS组大鼠心肌细胞中TUNEL染色阳性细胞明显增多(P＜0.01):与MS组比较,HLJDT组染色阳性细胞明显减少(P＜0.01)。 8.

s2(GenBank登记号)含有明确的polyA序列,提示TIRAP-AS是细胞中经过转录后加工的成熟RNA分子,并非基因组非特异性转录活动的产物。TIRAP蛋白在细胞中主要是参与MyD88依赖的信号转导途径,当特异性激活TLR2或TLR4时,TIRAP首先移位至细胞膜并通过其氨基端的磷脂酰肌醇二磷酸(phosphatidylinositol ATM激酶抑制剂体外 4,5-biphosphate, PIP2)结构域与PIP2结合,然后再通过保守的TIR(Toll/interleukin

1 receptor domain-containing)结构域与MyD88蛋白结合并将其募集至TLR受体,继而激活下游的MAPK蛋白激酶与转录因子NF-κB,诱导促炎细胞因子如TNF-a与IL-1等的表达。可见,TIRAP在MyD88依赖的信号通路的激活中具有不可替代的作用。综上所述,作为参与TLR受体信号传导通路的重要分子,TIRAP蛋白在细胞中的功能改变将直接导致机体的先天性免疫反应异常。但目前对TIRAP基因的表达调控机制还知之甚少,其天然反义RNA分子(TIRAP-AS)是否在细胞内调控TIRAP基因的表达?其具体的调控机制及其生物学意义是什么?对这些问题的深入研究将有助于揭示TIRAP基因在细胞中的表达调控机制,促进我们对TIRAP在先天性免疫反应中功能的进一步认识。针对上述科学问题,我们以已知的TIRAP-AS EST序列为基础,通过cDNA末端快速克隆(rapid amplification of cDNA ends,RACE) PCR技术从来源于小鼠的单核巨噬细胞RAW264.7中克隆获得TIRAP-AS的全长cDNA序列。我们克隆的TIRAP-AS基因cDNA存在十种不同形式的拼接体,其长度在1000nt至1200nt之间,与TIRAP Pazopanib化学结构 mRNA的重叠配对区(overlapping region)长度为447个核苷酸(nucleotide,nt).生物信息学分析显示这些TIRAP-AS分子缺乏明显的开放性阅读框,极有可能是非编码RNA分子。此外,TIRAP-AS基因内含子的剪切位置完全符合经典的GT-AG拼接(splicing)规则,存在典型的poly A加尾信号,而且我们克隆获得的TIRAP-AS cDNA序列3’末端含有polyA序列,表明TIRAP-AS在细胞中需要经过复杂的转录后加工。在获得TIRAP-AS RNA10种选择性拼接体序列的基础上,我们设计了可特异性区分它们的引物,以来源于RAW264.7细胞cDNA为模板,以含有TIRAP-AS选择性拼接体的质粒为阳性对照,进行PCR扩增,结果显示选择性拼接体1A、1B、1D与1E相对表达水平较高,是其在RAW264.7细胞中表达的主要形式。在此基础上,我们分别以含有TIRAP与TIRAP-AS

cDNA的质粒为标准参照,采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术分析了TIRAP mRNA与TIRAP-ASRNA分子在RAW264.7细胞中的相对表达水平,结果表明TIRAP mRNA的表达水平大约是TIRAP-AS RNA的8倍。此外,我们还采用了定量PCR分析了TIRAP mRNA与TIRAP-AS RNA在小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉、皮肤等8种不同的组织中的相对表达水平,以P-actin为内参照,结果显示TIRAP mRNA在不同组织中的表达水平由高到低依次为：肝>肌肉>心脏>肾>肺>脾>皮肤>脑,而TIRAP-AS

RNA分子在不同组织中的表达水平则为：肝>肌肉>心脏>肺>脑>皮肤>肾>脾。同时,我们还采用Western蛋白印迹分析了TIRAP蛋白质在不同组织中的表达水平,若以心脏为对照组,则它在脑组织中的表达相对较高,在脾、肺、肌肉等组织中的表达相当,在肝和皮肤组织中的表达相对较低,在肾组织中几乎不表达。由于TIRAP蛋白主要参与TLR2与TLR4激活后的下游信号转导,我们首先采用100ng/ml LPS (TLR4特异性激动剂)和100ng/ml Pam2CSK4(TLR2特异性激动剂)刺激RAW264.7细胞和,于不同时间点(Omin、30min、60min、 120min、240min、480min)收集细胞,采用实时荧光定量PCR技术检测TIRAP 没有 mRNA和TIRAP-AS RNA表达水平的变化,同时采用Western蛋白印迹技术检测TIRAP蛋白表达水平。结果显示：激活TLR2或TLR4受体可诱导RAW264.7细胞TIRAP mRNA和TIRAP-AS RNA水平均呈现出类似的时间依赖性改变；而且LPS刺激可诱导RAW264.7细胞中TIRAP蛋白呈现时间依赖性的下降。此外,采用100ng/ml LPS刺激C57BL/6小鼠骨髓来源巨噬细胞(bone marrow derived macrophage,BMM)诱导TIRAP mRNA和TIRAP-AS RNA表达水平的变化趋势与RAW264.7基本一致。为了进一步分析其他类型的TLR受体激活对TIRAP mRNA与TIRAP-ASRNA表达水平的影响,我们分别采用小鼠TLR1-9不同激动剂刺激RAW264.7细胞1h,回收细胞并采用实时荧光定量PCR分析TIRAP mRNA和TIRAP-ASRNA的表达水平的变化,结果显示100 ng/ml Pam3CSK4(TLR1/2特异性激动剂)与5μM ODN1826(TLR9特异性激动剂)同样可以诱导RAW264.