s2(GenBank登记号)含有明确的polyA序列,提示TIRAP-AS是细胞中经过转录后加工的成熟RNA分子,并非基因组非特异性转录活动的产物。TIRAP蛋白在细胞中主要是参与MyD88依赖的信号转导途径,当特异性激活TLR2或TLR4时,TIRAP首先移位至细胞膜并通过其氨基端的磷脂酰肌醇二磷酸(phosphatidylinositol ATM激酶抑制剂体外 4,5-biphosphate, PIP2)结构域与PIP2结合,然后再通过保守的TIR(Toll/interleukin
1 receptor domain-containing)结构域与MyD88蛋白结合并将其募集至TLR受体,继而激活下游的MAPK蛋白激酶与转录因子NF-κB,诱导促炎细胞因子如TNF-a与IL-1等的表达。可见,TIRAP在MyD88依赖的信号通路的激活中具有不可替代的作用。综上所述,作为参与TLR受体信号传导通路的重要分子,TIRAP蛋白在细胞中的功能改变将直接导致机体的先天性免疫反应异常。但目前对TIRAP基因的表达调控机制还知之甚少,其天然反义RNA分子(TIRAP-AS)是否在细胞内调控TIRAP基因的表达?其具体的调控机制及其生物学意义是什么?对这些问题的深入研究将有助于揭示TIRAP基因在细胞中的表达调控机制,促进我们对TIRAP在先天性免疫反应中功能的进一步认识。针对上述科学问题,我们以已知的TIRAP-AS EST序列为基础,通过cDNA末端快速克隆(rapid amplification of cDNA ends,RACE) PCR技术从来源于小鼠的单核巨噬细胞RAW264.7中克隆获得TIRAP-AS的全长cDNA序列。我们克隆的TIRAP-AS基因cDNA存在十种不同形式的拼接体,其长度在1000nt至1200nt之间,与TIRAP Pazopanib化学结构 mRNA的重叠配对区(overlapping region)长度为447个核苷酸(nucleotide,nt).生物信息学分析显示这些TIRAP-AS分子缺乏明显的开放性阅读框,极有可能是非编码RNA分子。此外,TIRAP-AS基因内含子的剪切位置完全符合经典的GT-AG拼接(splicing)规则,存在典型的poly A加尾信号,而且我们克隆获得的TIRAP-AS cDNA序列3’末端含有polyA序列,表明TIRAP-AS在细胞中需要经过复杂的转录后加工。在获得TIRAP-AS RNA10种选择性拼接体序列的基础上,我们设计了可特异性区分它们的引物,以来源于RAW264.7细胞cDNA为模板,以含有TIRAP-AS选择性拼接体的质粒为阳性对照,进行PCR扩增,结果显示选择性拼接体1A、1B、1D与1E相对表达水平较高,是其在RAW264.7细胞中表达的主要形式。在此基础上,我们分别以含有TIRAP与TIRAP-AS
cDNA的质粒为标准参照,采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术分析了TIRAP mRNA与TIRAP-ASRNA分子在RAW264.7细胞中的相对表达水平,结果表明TIRAP mRNA的表达水平大约是TIRAP-AS RNA的8倍。此外,我们还采用了定量PCR分析了TIRAP mRNA与TIRAP-AS RNA在小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉、皮肤等8种不同的组织中的相对表达水平,以P-actin为内参照,结果显示TIRAP mRNA在不同组织中的表达水平由高到低依次为：肝>肌肉>心脏>肾>肺>脾>皮肤>脑,而TIRAP-AS
RNA分子在不同组织中的表达水平则为：肝>肌肉>心脏>肺>脑>皮肤>肾>脾。同时,我们还采用Western蛋白印迹分析了TIRAP蛋白质在不同组织中的表达水平,若以心脏为对照组,则它在脑组织中的表达相对较高,在脾、肺、肌肉等组织中的表达相当,在肝和皮肤组织中的表达相对较低,在肾组织中几乎不表达。由于TIRAP蛋白主要参与TLR2与TLR4激活后的下游信号转导,我们首先采用100ng/ml LPS (TLR4特异性激动剂)和100ng/ml Pam2CSK4(TLR2特异性激动剂)刺激RAW264.7细胞和,于不同时间点(Omin、30min、60min、 120min、240min、480min)收集细胞,采用实时荧光定量PCR技术检测TIRAP 没有 mRNA和TIRAP-AS RNA表达水平的变化,同时采用Western蛋白印迹技术检测TIRAP蛋白表达水平。结果显示：激活TLR2或TLR4受体可诱导RAW264.7细胞TIRAP mRNA和TIRAP-AS RNA水平均呈现出类似的时间依赖性改变；而且LPS刺激可诱导RAW264.7细胞中TIRAP蛋白呈现时间依赖性的下降。此外,采用100ng/ml LPS刺激C57BL/6小鼠骨髓来源巨噬细胞(bone marrow derived macrophage,BMM)诱导TIRAP mRNA和TIRAP-AS RNA表达水平的变化趋势与RAW264.7基本一致。为了进一步分析其他类型的TLR受体激活对TIRAP mRNA与TIRAP-ASRNA表达水平的影响,我们分别采用小鼠TLR1-9不同激动剂刺激RAW264.7细胞1h,回收细胞并采用实时荧光定量PCR分析TIRAP mRNA和TIRAP-ASRNA的表达水平的变化,结果显示100 ng/ml Pam3CSK4(TLR1/2特异性激动剂)与5μM ODN1826(TLR9特异性激动剂)同样可以诱导RAW264.