TTC结果：模型组24h相对梗死体积为24.73±0.97％，干预组24h相对梗死体积为13.46±0.64％，差异有显著性(P<0.05）；干预组：干预后可以显著减少大鼠脑缺血再灌注损伤后凋亡细胞数量，与模型组相比，干预组除了再灌注后2h外其它时间点凋亡细胞数均明显减少（P
现如今，肿瘤是危害人类健康最严重的疾病之一。在我国，近年来恶性肿瘤已成为死因谱中第一位的死亡原因，严重危害人们的健康和生命。因此，肿瘤的预防和控制已经成为当前最重要的卫生工作之一。研究表明，人类约有40%~60%的肿瘤是由化学因素引起的，而化学因素又主要与饮食有关。因此，对肿瘤的膳食预防是一项积极的防癌策略。近几年，膳食中的抗癌、防癌物质已经成为肿瘤化学预防的研究热点。牛磺酸(Taurine，Tau)是具有简单化学结构的含硫氨基酸。人体内Tau的含量较高，约占人体体重的0.1%，几乎全部以游离形式存在于所有脏器中。大量的国内外研究及临床应用发现，Tau具有广泛的生理功效，是机体内源性抗损伤物质，但是关于Tau抗肿瘤作用方面的研究较少，作用机制也尚未明确。

购买Rigosertib 目的： 观察Tau对肿瘤细胞凋亡的影响，并探讨其可能的作用机制。 方法： 检测Tau对肿瘤细胞生长的影响。实验采用4株肿瘤细胞和1株人正常细胞，分别是人乳腺癌细胞MCF-7（p53野生型，p53+/+）和MDA-MB-231（p53突变型，p53-/-）、人结肠癌细胞LoVo（p53+/+）和HT-29（p53-/-）以及人胚肾细胞293T。用不同浓度（0mM、10mM、20mM、40mM、80mM、160mM）的Tau分别处理4株肿瘤细胞和人胚肾细胞一定时间后，MTT检测其细胞活性的改变；应用流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡率的改变；应用Hoechst33342核染法观察肿瘤细胞凋亡的形态学改变；RT-PCR和Western blot方法检测PUMA及凋亡相关基因BAX、Bcl-2的mRNA及蛋白水平的表达变化；分光光度法检测MDA-MB-231的Caspase-3活性变化。 应用脂质体转染的方法将PUMA特异性siRNA（PUMA-siRNA，si-PUMA）转染人结肠癌细胞LoVo，检测PUMA沉默后对Tau诱导肿瘤细胞凋亡的影响。用lipofectamine2000（lipo2000）包裹不同浓度的带有荧光标记的FAM-siRNA（si-FAM）转染LoVo细胞，检测其转染效率。在筛选si-PUMA片段的实验中，将实验分为6组：①Control组，②siRNA片段Ⅰ，③siRNA片段Ⅱ，④siRNA片段Ⅲ，⑤阳性对照组（Positive SB505124溶解度 Control，PC），⑥阴性对照组（Negative Control，NC），并转染48h后，用RT-PCR和Western blot方法检测各组PUMA表达情况，筛选出沉默效率较高的si-PUMA片段。为检测PUMA对Tau诱导肿瘤细胞凋亡的影响，采用瞬时转染法将si-PUMA转染LoVo细胞，实验分为4组：①Control组，②NC组，③si-PUMA组，④si-PUMA+Tau80mM组。实验于48h后，采用流式细胞术检测LoVo的细胞凋亡率；Western

blot方法检测PUMA及凋亡相关基因BAX、Bcl-2蛋白的表达变化。

结果： 随着Tau浓度和处理时间的增加，4株肿瘤细胞的增殖活性均出现降低趋势，Tau对肿瘤细胞的抑制率出现逐渐升高趋势。计算Tau作用48h后的IC50发现，人乳腺癌细胞MCF-7（p53+/+）的IC50（133.61mM）比MDA-MB-231（p53-/-）的IC50（127.21mM）大1.05倍，人结肠癌细胞LoVo（p53+/+）的IC50（297.81mM）比HT-29（p53-/-）的IC50（45.66mM）大4.76倍，提示Tau对p53-/-肿瘤细胞抑制作用更加明显。但Tau作用于正常人胚肾细胞293T24h和48h后，其细胞活性并无显著性影响，只是在72h后的较高浓度组对293T细胞出现轻微抑制，这就提示Tau对人正常细胞的增殖影响并不明显。流式细胞术结果发现，随着Tau浓度的增加，两组肿瘤细胞的凋亡率均逐渐升高，并且p53-/-细胞比p53+/+细胞的凋亡率增加更加明显，这与MTT结果相似。Hoechst33342核染色发现，Tau80mM处理48h后，肿瘤细胞的细胞核均出现不同程度的致密浓染或碎块状致密浓染的典型的细胞凋亡形态。RT-PCR图像分析显示：随着Tau浓度的增加，两组肿瘤细胞的促凋亡基因PUMA，BAX 并且 mRNA表达水平都出现上调，抗凋亡基因Bcl-2mRNA表达水平出现下调。Western blot结果显示：随着Tau浓度的增加，两组细胞中促凋亡蛋白PUMA和BAX水平出现明显上调，抗凋亡蛋白Bcl-2水平明显下调。Caspase-3活性检测发现，Tau处理MDA-MB-231细胞48h后，Caspase-3活性显著升高，Tau40mM是Control组的（1.33±0.13）倍，Tau80mM是Control组的（3.25±0.16）倍，Tau160mM是Control组的（4.39±0.24）倍。 不同浓度的si-FAM转染LoVo细胞，表现出不同的转染效率。当si-FAM浓度为100nM时转染效率比较高，为61.34%。RT-PCR和Western blot结果发现，3个siRNA片段都不同程度的下调了PUMA mRNA和PUMA蛋白的表达，其中siRNA片段Ⅱ下调PUMA表达效果最显著。siRNA特异性干扰LoVo细胞PUMA基因表达后，si-PUMA组的早期凋亡率（5.16±0.19）%和晚期凋亡率（4.29±0.35）%较Control组早期凋亡率（9.39±0.32）%和晚期凋亡率（7.50±0.34）%相比均明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。si-PUMA+Tau组的早期凋亡率（9.52±0.35）%和晚期凋亡率（9.28±0.11）%与si-PUMA组相比均出现升高，差异有统计学意义（P<0.05）。而si-PUMA+Tau组早期凋亡率与Control相比没有明显差异，但是其晚期凋亡率较Control组（7.50±0.

84、31.31、45.43，经各组间两两比较进行秩和检验，其表达差异均有统计学意义（HC=24.63，P＜0.05）；IL-17R在减压脑组织、低级别及高级别胶质瘤中存在阳性表达，其阳性率分别为50%、83%、100%，平均秩次分别为18.42、35.73、49.65，经各组间两两比较进行秩和检验，其表达差异均有统计学意义（HC=28.42，P＜0.05）。(2) RT-PCR方法检测结果，IL-17mRNA在对照组减压脑组织、低级别及高级别组胶质瘤组织中表达的灰度值分别为31.62±1.95、85.79±4.58、134.77±6.32， IL-17RmRNA表达为76.20±3.97、137.66±64、193.82±6.20，经方差分析(F=221.04，p<0.05)，且组间比较均有统计学差异（p0.05)，差异无统计学意义，余组间比较均有统计学差异（p<0.05)，且组间比较均有统计学差异（p0.05)，差异无统计学意义，余组间比较均有统计学差异（p<0.001)。结论：IL-17和IL-17R在不同级别胶质瘤组织和外周血中的表达有差异，且与胶质瘤的病理分级密切相关，随着胶质瘤级别的增高而增多、增强；相同胶质瘤患者外周血及相对应的胶质瘤组织中的表达有明显正相关；IL-17和IL-17R的表达可能是判断胶质瘤恶性程度的参考指标。
目的通过正交试验法验证胡黄连苷Ⅱ对大鼠脑缺血损伤的神经保护作用并优化其治疗的最佳剂量及时间窗。

mTOR抑制剂 方法应用双侧颈总动脉结扎法建立大鼠前脑缺血模型,按照正交试验设计分组,经腹腔注射胡黄连苷Ⅱ干预治疗。甲苯胺蓝染色法观察神经细胞结构；流式细胞术观察细胞早期凋亡率；免疫组织化学法和蛋白免疫印迹法(Western blot)定性、定量检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)表达；反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测NSE mRNA转录水平。 结果胡黄连苷Ⅱ治疗大鼠脑缺血损伤的最佳时间和剂量：根据甲苯胺蓝染色显示为脑缺血2.0h腹腔注射胡黄连苷Ⅱ10mg/kg；流式细胞术检测显示为脑缺血1.5h腹腔注射胡黄连苷Ⅱ10mg/kg；免疫组织化学法分析为脑缺血2.0h腹腔注射10mg/kg； Western blot分析为脑缺血2.Oh给予10mg/kg；RT-PCR显示为脑缺血1.5h给予10mg/kg. 结论根据用药剂量最小化和治疗时间窗最大化的原则综合评价,胡黄连苷Ⅱ治疗脑缺血损伤的最佳治疗时间窗为脑缺血1.5-2.0h,腹腔注射胡黄连苷Ⅱ10mg/kg。
背景

Etoposide供应商 阿片类药物成瘾是一种慢性、高复发性脑病。长期戒断后复吸是临床上治疗成瘾的主要难题。与药物摄取相关的环境线索及药物带来的奖赏记忆之间形成稳定的、长期存在的记忆,是导致人类和动物复吸的主要原因。这种稳定的记忆被唤起之后变得不稳定和极易被破坏,需要重新巩固,即再巩固。肌动蛋白重组参与树突棘的形成,在记忆形成中发挥重要作用,是否在吗啡奖赏记忆再巩固中发挥关键作用,有待进一步深入探讨。 目的 本研究以肌动蛋白(actin)为切入点,研究伏隔核(nucleus accumbens,NAc)脑区actin重组在吗啡奖赏记忆再巩固中的作用,为治疗成瘾提供新的治疗靶点。 也许 方法 对大鼠伏隔核核部和壳部进行立体定位手术,术后恢复5-7天。隔天交替给予吗啡(10mg/ml/kg)和生理盐水(1ml/kg),在训练箱中停留45min,共8天。第9天进行CPP测试,确定吗啡是否可以诱导CPP的形成。根据不同的实验设计共分为4个大组,1.暴露组：core+Latrunculin A(actin重组抑制剂),core+对照,shell+Latrunculin A,shell+对照,24h后观察Latrunculin A对CPP的影响;2.暴露后6h组：shell+Latrunculin A,shell+对照,24h后观察Latrtunculin A对CPP的影响；3.未暴露组：shell+Latrunculin A,shell+对照,24h后观察Lattunculin A对CPP的影响；4.Latrunculin A对吗啡CPP表达的影响是否长期存在组：shell+Latrunculin A,shell+对照,在给药后第1和14天测试CPP,在第15天测试前给予低剂量吗啡(3mg/ml/kg),观察吗啡对CPP复燃的影响。 结果 1.抑制actin重组对吗啡药物奖赏记忆再巩固行为学的影响 经过8天的CPP训练,各组均形成了CPP。与对照组相比,暴露后向NAc shell脑区微注射actin重组抑制剂Latrunculin A可以显著降低吗啡CPP的表达(P0.05)。 2.抑制actin重组对吗啡药物奖赏记忆再巩固行为学的影响与再巩固时间窗的关系 经过8天的CPP训练,各组均形成了CPP。与对照组相比,在暴露6h后向NAcshell脑区微注射actin重组抑制剂Latrunculin A对吗啡CPP无明显影响(P>0.05)。 3.

001,P<0.001)。786-mut1和786-mut2细胞的PIK3R1基因蛋白表达量也降低。与野生型细胞相比,A-704-mutl和A-704-mut2细胞的PIK3R1基因mRNA的表达量亦均显著下降(P<0.001,P<0.001)。A-704-mut1和A-704-mut2细胞的PIK3R1基因蛋白表达量也降低。与野生型细胞相比,786-mutl和786-mut2细胞的平板克隆数均显著性增加(P<0.001,P<0.001)。与野生型A-704细胞相比,A-704-mut1和A-704-mut2细胞形成的干细胞球数亦均显著增多(P<0.001,P<0.001,P<0.001)、(P<0.001,P

<0.001,P<0.001)、(P<0.001,P<0.001)、(P<0.001)。PIK3R1低表细胞中CD44、CD133和CXCR4阳性细胞亚群比例高于野生型细胞中的该类型细胞亚群比例。与786-0细胞相比,786-mmutl和786-mut2细胞中CTNNB1基因表达量显著增高(P<0.001,P<0.001,P<0.001,P<0.001,P<0.001,P<0.001,P
背景:白癜风是以局限性脱色斑、功能性黑素细胞减少或消失为特征的获得性皮肤病,是一种多发性、难治性疾病,发病率逐年上升。白癜风的发病机制尚未被清楚地阐明,现有的研究结果涉及多个学说。近年来越来越多的研究认为,白癜风是遗传因素和环境因素共同作用,造成黑素细胞受到损伤的结果。在特定的个体遗传背景下,氧化应激可能是白癜风皮损最早期的事件,它启动黑素细胞的破坏或凋亡,诱导针对自身抗原的特异性免疫应答。很多研究表明,白癜风患者的表皮有H2O2的蓄积,从而引起黑素细胞的氧化损伤。可通过H2O2建立诱导黑素细胞的氧化应激损伤体外模型,对白癜风复杂的发病机制进一步研究。遗传学研究显示,个体罹患疾病的易感性由基因遗传变异决定。一些位于基因编码区的SNP或突变可影响基因的表达和功能,与白癜风的发病相关。在分子流行病学研究检测出的易感候选基因中,中国家族性白癜风患者携带血小板源性生长因子受体α(PDGFRα)编码基因位点突变率显著高于正常人群,支持该基因在部分白癜风患者发病中可能具有作用。同时研究显示氧化应激可诱导PDGFRα酪氨酸磷酸化,PDGFRα促进氧化应激损伤中一些种类的细胞的生存。那么在H2O2诱导黑素细胞氧化应激损伤中,PDGFRα及其下游信号通路是否在黑素细胞生存中发挥作用,成为本课题研究的主要内容。目的:本课题通过调节PDGFRα基因PDGFRA的表达,研究该基因对人黑素细胞的自噬、凋亡现象及一些重要功能蛋白的影响和作用机制,以阐述PDGFRα在H2O2诱导的氧化应激损伤中与黑素细胞生存相关的生物学功能。方法:1.采用RT-PCR和Western-blot的方法,分别检测人原代黑素细胞、正常人表皮永生化黑素细胞系PIG1、白癜风患者表皮永生化黑素细胞系PIG3V中PDGFRA的m

selleck化学药品 时间 RNA和蛋白的表达情况。2.分别在正常人黑素细胞系PIG1、白癜风患者黑素细胞系PIG3V中,采用CCK-8的方法检测细胞活性并确定最适H2O2处理终浓度。分别在不同时间和使用不同浓度H2O2处理黑素细胞PIG1,采用Western-blot的方法检测PDGFRα的表达变化。3.分别转染黑素细胞PIG1、黑素细胞PIG3V

selleckchem PDGFRA-si RNA、人PDGFRA过表达质粒,采用q RT-PCR、Western-blot的方法,检测两种黑素细胞系中PDGFRA的m RNA和蛋白的表达情况。4.分别下调和上调黑素细胞PIG1、黑素细胞PIG3V的PDGFRA并经H2O2处理24h后,采用流式细胞术的方法检测两种黑素细胞的凋亡情况。5.分别下调和上调黑素细胞PIG1、黑素细胞PIG3V的PDGFRA并经H2O2处理24h后,采用Western-blot的方法检测两种黑素细胞的自噬相关蛋白、抗凋亡相关蛋白及黑素小体相关蛋白的表达情况。6.确定PDGFRα特异性配体PDGF-AA的最适处理浓度后,使用PDGF-AA或/和H2O2处理黑素细胞PIG1 24h,采用Western-blot的方法检测黑素细胞PIG1中PDGFRα、主要自噬蛋白、黑素细胞功能核心调节分子,以及PI3K/AKT/m TOR通路分子的表达情况。7.转染表达人LC3的荧光蛋白质粒后,分别用PDGF-AA和H2O2处理两种黑素细胞24h,在荧光显微镜下观察黑素细胞胞质中自噬体的形成情况。之后采用CCK-8的方法检测黑素细胞PIG1活性以确定该通路抑制剂最适处理浓度并处理,采用Western-blot的方法检测PDGFRα及下游相关通路分子的表达情况。结果:1.在体外培养的人原代黑素细胞、正常人黑素细胞系PIG1、白癜风患者黑素细胞系PIG3V中均检测出PDGFRα基因m RNA和蛋白的表达。2.在两种黑素细胞中建立的氧化应激损伤模型中,确定了正常人黑素细胞系PIG1和白癜风患者黑素细胞系的H2O2处理最适终浓度。在黑素细胞PIG1中分别给予不同浓度的H2O2处理,检测到PDGFRα的表达与H2O2呈正相关。在不同时间点给予H2O2处理黑素细胞PIG1,检测到PDGFRα的表达在30 min内明显增加。3.在黑素细胞PIG1、黑素细胞PIG3V中,筛选出干涉PDGFRα基因m RNA和蛋白表达的最适si RNA。将PDGFRα基因过表达质粒分别转染这两种黑素细胞,检测到该基因m RNA和蛋白表达显著增加。4.在黑素细胞PIG1、黑素细胞PIG3V中分别上调和下调PDGFRα基因并诱导氧化应激,流式细胞术结果显示:两种黑素细胞中,与对照组相比,转染PDGFRA-si RNA的黑素细胞凋亡率明显增加(P<0.

禽流感病毒H5N1的NA接种小鼠引起小鼠肺脏Th17细胞数量增加。 通过对5周龄的小鼠鼻腔接种H5N1的神经氨酸酶,取小鼠肺脏组织的T细胞进行流式细胞术检测Th17和Treg细胞分化。结果发现,经过H5N1的神经氨酸酶感染后的小鼠肺脏Th17的细胞比例显著上升,并且呈现剂量依赖性。

2.禽流感病毒的NA能诱导小鼠骨髓来源的树突状细胞成熟 通过小鼠BMDC的体外培养,用脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS),H1N1的NA,H5N1的NA,H9N2的NA及热灭活的H5N1的NA以及卵清蛋白(OVA)分别在BMDC培养的不同时间段对树突状细胞进行刺激,然后通过流式细胞术检测树突状表面的MHC-11分子以及共刺激分子CD40, CD80, CD83和CD86。结果发现,禽流感病毒的NA均能促进树突状细胞的成熟,并且在一定范围内存在剂量依赖性,并推测是NA的酶活性促进了树突状细胞的成熟。 3.禽流感病毒H5N1的NA能诱导Th17及其它CD4+T细胞分化 通过小鼠BMDC和小鼠脾脏CD4+T细胞体外共培养,用H5N1的NA以及其他的样品对共培养的细胞进行刺激,并利用ELISA,荧光定量PCR以及流式细胞术对各个样品进行检测。结果发现,H5N1的NA能通过BMDC在第五天和第九天诱导小鼠Th17及其它CD4+T细胞分化。通过实验结果推测,早期由IL-21和TGF-β,随后由IL-6和TGF-β主导CD4+T细胞的Thl7分化。在此过程中,H5N1的NA能诱导相应各类炎症因子的释放,如TGF-β1、IL-6、IL-21、IL-23、IL-1β、IL-17A、IL-10等。
转化生长因子-β GSK2118436化学结构 (transforming growth factor-p, TGF-p)信号通路在细胞生长、增殖、分化、凋亡以及胚胎的发育中都具有极其重要的作用,TGF-β信号通路能否得到正常调节与人类多种疾病的发生密切相关。Smad家族蛋白是TGF-β信号通路中的关键信号转导蛋白,它们主要包括受体调节型Smad (receptor regulated Smad, R-Smad),通用转导型Smad (common mediator Smad, Co-Smad, Smad4)以及抑制型的Smad (inhibitory Smad, I-Smad)。 Smad4在整个TGF-p信号通路中起着核心的作用,它在受到TGF-β刺激后,能够与R-Smads相结合,从细胞质转移到细胞核,在核内Smad4能够与不同的转录调节因子结合调控下游基因的表达,从而调控TGF-p信号所介导的各种生理效应。 BRD7(bromodomain containing7)最早是从鼻咽癌细胞与正常细胞的基因差异表达筛选中得到的。BRD7是染色体重组复合物SWI/SNF的一员,能够通过Bromo结构域与组蛋白结合进而影响染色体重组。已有研究表明,BRD7能够参与WNT、ras/MEK/ERK以及Rb/E2F信号通路的转导,但是BRD7在TGF-β信号通路中的研究目前还没有报道。

哪里 本研究通过酵母双杂交实验发现了BRD7与TGF-β信号通路关键因子Smad4具有相互作用,之后我们分别在体内和体外证实了BRD7与Smad4的确存在相互作用,并且找到了其相互作用的区域。随后,我们通过荧光素酶报告基因实验证明了BRD7是TGF-p信号通路的促进因子。同时,通过对TGF-p信号通路诱导的下游基因表达的检测验证了这一促进效应。BRD7调节TGF-p信号通路的转导主要通过两方面。一方面,BRD7能够通过Bromo结构域结合乙酰化的H3K9从而促进Smad4结合DNA,另一方面,BRD7与p300的相互作用能够促进Smad4的转录活性。最后,我们在细胞水平上证实了BRD7能够影响TGF-β信号通路调控的细胞增殖、细胞周期及上皮细胞向间充质细胞的转变(epithelial-mesenchymal

transition, EMT)现象等功能。 综合我们的研究表明,BRD7蛋白能够通过对TGF-β信号通路关键因子Smad4的调节参与TGF-β信号通路的转导,并且能够影响TGF-β在细胞水平上对多种细胞行为的调节。此研究为进一步理解TGF-p信号通路的调节机制以及进一步理解BRD7在癌症发生中的功能和机制提供理论依据的基础。
转化生长因子-β (Transforming Growth Factor-β或者TGF-β)作为一种重要的细胞因子在细胞的生长、增殖、分化中发挥着非常重要的调控作用。因此,TGF-β信号通路的调控异常与人类多种疾病密切相关如癌症等。在TGF-β信号传递过程中Smads蛋白发挥了重要的作用。Smads家族蛋白根据其结构和功能可以分为三大类,分别是受体激活的R-Smads(如Smad2/3),通用转导的Co-Smad,以及抑制型的I-Smads,在经典的TGF-β信号通路中,配体与细胞表面的受体结合,从而引起R-Smads的磷酸化。磷酸化的R-Smads与Co-Smad结合形成三聚体进入细胞核,结合到特定的DNA序列从而调控下游基因的表达。 或者 在TGF-β信号通路中,转录水平的研究已经比较清楚,但是转录后水平的调控机制还不是非常清晰。基因在转录后,需要经过剪接加工成为成熟的mRNA,最后翻译成为蛋白质。经典的转录后剪接加工调控主要是通过RNA结合蛋白识别mRNA上的增强或抑制单元来实现的。在TGF-β信号通路中,RNA结合蛋白如何参与其转录后调控的机制还不清晰。本研究拟以构建RNA结合蛋白文库为载体,结合细胞水平和分子水平的实验,研究RNA结合蛋白在TGF-β信号通路中的调控作用。 根据RNA结合蛋白数据库中的信息,在人类细胞中有235个蛋白含有一个或多个RNA结合单元(RNA Recognition Motif或者RRM)。对照cDNA文库(Human ORFeome5.

MDS患者骨髓细胞中CD34+CD38-CD123+细胞比例 ①高、低危组患者骨髓单个核细胞中CD34+CD38-CD123+细胞所占比例分别为(0.48±0.27)%和(0.02±0.01)%,显著高于正常对照组[(0.00±0.00)%,P值均<0.05],且高危组患者高于低危组患者(P<0.01和<0.05],且高危组高于低危组患者(P<0.01和<0.05)和正常对照组CD34+CD38-CD123细胞(63.06±21.06,P值分别<0.01和0.05)： ②EPO刺激的高、低危组患者CD34+CD38-CD123+细胞P-STAT5表达水平分别为239.45±152.05和144.04±58.11,明显高于CD34+CD38-CD123-细胞(64.21±23.43和68.41±25.10,P值均<0.01)和正常对照组CD34+CD38-CD123-细胞(75.21±27.02,P0.05)。 ③EPO刺激后,高、低危组患者CD34+CD38-CD123+细胞P-STAT5表达水平的中位增高值分别为28.855和21.805,明显高于CD34+CD38-CD123细胞(5.50和7.415,P值分别<0.01和<0.05)和正常对照组CD34+CD38-CD123细胞(6.39,P值分别<0.01和0.05)；EPO刺激前后CD34+CD38-CD123+细胞P-STAT5表达水平及刺激后增高水平在高、低危组患者间差异无统计学意义； ⑤MDS患者组CD34+CD38-CD123+细胞、CD34+CD38-CD123-细胞与正常对照组CD34+CD38-CD123-细胞间比较STAT5总表达量差异无统计学意义。

许多 3.MDS患者CD34+CD38-CD123+细胞P-STAT5与临床相关性

①高危MDS组CD34+CD38-CD123+细胞P-STAT5水平与骨髓CD34+CD38-CD123+细胞比例呈正相关(r=0.454,P
目的探讨葡萄糖神经酰胺合成酶（glucosylceramide synthase, GCS）在白血病细胞的耐药形成过程中是否经过细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulatedkinase，ERK）通路来影响P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的表达。 方法应用RNA干扰技术和实时荧光定量PCR技术，观察针对GCS的siRNA（GCSsiRNA）及ERK特异性化学抑制剂U0126分别作用于白血病耐药细胞株K562/A02细胞后，在不同的情况下MDR1mRNA的表达情况；同时应用Westernblot印迹分析方法检测经转染GCSsiRNA后细胞中ERK1/2（extracellularsignal-regulated 点击此处 kinase1/2）蛋白的磷酸化及非磷酸化的表达，及各组中P-gp的表达水平。 结果与空白对照组比较，当ERK抑制剂U0126的浓度为10μmol/L时,对磷酸化ERK1/2(phosphorylated-ERK1/2, P-ERK1/2)没有明显抑制，P-gp表达亦没有明显差别；而随着U0126浓度的逐渐升高，即20μmol/L、40μmol/L、60μmol/L时对P-ERK1/2的抑制则呈浓度依赖性增强，同时P-gp的表达水平亦被明显下调。RNA干扰实验显示：GCSsiRNA实验组的GCSmRNA表达被明显抑制，抑制率为70.50%（58.00%～76.00%）；与阴性干扰对照组比较，GCSsiRNA实验组在siRNA转染48小时后P-ERK1/2的表达水平显著下降（P<0.01），此时，对P-gp的表达尚未出现明显影响，但转染72小时后P-gp的表达被明显下调（P
目的：通过测定在2型糖尿病及正常人群中脂联素(adiponectin,ANDP)的水平,来研究ANDP与空腹血糖、血脂的相关性,并进一步研究ANDP在2型糖尿病患者骨组织中骨吸收及骨形成过程可能存在的相互关系。

方法： ①随机抽取确诊2型糖尿病患者63名及正常成年人53名,分别作为观察组和对照组；根据骨密度结果将观察组分为骨量正常、骨量减少和骨质疏松三组。 ②在相同条件下测定身高、体重,用双能X线法测定骨密度,用酶联免疫吸附法(ELISA)测定ANDP,用葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖,用酶法测定总胆固醇、甘油三酯。 ③本研究统计软件采用SPSS19.0分析计算。 结果： 1.与对照组相比,观察组ADPN较低,差异有统计学意义(P0.05),与骨量正常组比较时差异均有统计学意义(P0.05)。 4.观察组中个指标与BMD的相关性如下： (1)ADPN水平与BMD呈负相关,其中r=-0.546,(P0.05)。 5.在观察组中,以BMD为因变量,校正ADPN、BMI、TG、TC、FPG、ALP、血钙、血磷、年龄相关因素,多元逐步线性回归结果示,ADPN、BMI和TG进入BMD方程。 结论： 1.2型糖尿病患者体内脂联素和骨密度水平较正常人低； 2.2型糖尿病患者中骨量正常、骨量减少及骨质疏松三组脂联素水平依次增高；BMI水平依次减低； 3.多元线性回归发现,ADPN、BMI和TG可能是骨密度值影响指标。
目的颈动脉狭窄和闭塞是老年2型糖尿病患者常见的合并症之一,颈动脉粥样硬化性狭窄或斑块脱落是缺血性脑卒中的主要原因。糖尿病患者颈动脉粥样硬化及斑块形成与内皮祖细胞(EPCs)减少和功能障碍相关。本研究观察老年2型糖尿病脑梗死患者颈动脉粥样硬化与外周血内皮祖细胞水平的相关性,并分析其在2型糖尿病脑梗死发生发展中的作用和临床意义,探讨糖尿病脑梗死的相关机制,从而为进一步治疗及预防老年2型糖尿病患者颈动脉粥样硬化和脑梗死提供依据。 selleck化学 方法本实验采用病例对照研究,选取2010.10至2011.10在天津医科大学总医院干部保健科就诊的106例老年患者,根据疾病不同分成三组：(1)单纯糖尿病组(DM组),n=42；(2)糖尿病脑梗死组(DMCI组),n=34；(3)对照组(CN组),n=30,为同期在干部保健科进行健康体检的人群中随机抽取的无糖尿病、脑血管病史的个体。根据颈动脉粥样硬化斑块的有无,进一步将各组分为有斑块组(EP组)、无斑块组(NP组)；再根据斑块的性质,将EP组分为稳定斑块组(SP组)与不稳定斑块组(USP组)。对入选者进行病史采集,测量血压、身高、体重,并计算体重指数(BMI)；取清晨空腹静脉血：应用流式细胞仪测定内皮祖细胞(EPCs)数量；应用酶联免疫方法检测血管内皮生长因子(VEGF)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)水平；应用葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖(FBG)；应用高效液相色谱法测定糖化血红蛋白(HbA1c)水平；应用全自动生化分析仪测定血甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C);采用高频率彩色多普勒超声检测三组颈动脉内中膜厚度(IMT)及斑块形成情况。 结果(1)三组患者的SBP、EPCs、MMP-9、VEGF、TC、HDL-C、LDL-C、 FBG、HbA1c (P<0.05)；DMCI、DM组的TG高于CN组(P<0.

2 TGF-β1诱导VSMC分化标志基因SM22α和SMα-actin表达 SM22α和SMα-actin表达是VSMC处于分化状态的重要分子标志, PCNA表达是VSMC处于增殖状态的重要标志。采用Western blot方法,检查TGF-β1对各种标志基因表达的影响。结果显示,在TGF-β1处理的VSMC中,分化标志基因SM22α和SMα-actin表达明显升高,而增殖标志物PCNA表达显著降低,这些基因的表达变化依赖于TGF-β1作用的时间和浓度。其中,浓度为2 www.selleck.cn/Bcl-2.html ng/ml和作用时间为48 h时变化最为显著。 1.3敲减TβRI表达对VSMC分化和去分化标志基因表达的影响 将靶向TβRI的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)导入VSMC,阻断内源性TβRI表达后,研究TβRI在TGF-β1诱导VSMC分化中的作用。Western blot结果显示,转染TβRI-siRNA可使TβRI mRNA和蛋白表达水平降低约75~80%,表明该基因的表达被有效敲低。在TGF-β1刺激下,转染TβRI-siRNA的VSMC中SM22α和SMα-actin的表达明显降低,相反,增殖标志物PCNA的表达显著增加。 1.4 KLF4在TGF-β1诱导TβRI表达及VSMC分化中的作用 虽然已经发现KLF4是参与细胞生长、分化和凋亡的调控,但KLF4是否通过TβRI介导TGF-β1的作用目前尚不清楚。 RT-PCR和Western

blot结果表明,TGF-β1显著诱导KLF4和TβRI基因的转录和蛋白表达,并具有明显的时-效(6、12、24、48 h)关系。2 ng/ml TGF-β1作用于VSMC 6 h后,KLF4和TβRI的mRNA和蛋白表达水平均显著升高,两者的表达变化呈正相关关系。 为了阐明KLF4与TβRI表达之间的关系,将KLF4-siRNA导入VSMC,阻断内源性KLF4表达后,明确KLF4在TGF-β1诱导TβRI及VSMC分化标志基因表达中的作用。RT-PCR和Western Ku 0059436 blot分析结果显示,转染KLF4-siRNA可敲减KLF4表达60%以上。在敲低KLF4表达的VSMC中,TGF-β1诱导TβRI表达的作用被取消,分化标志基因SM22α和SMα-actin的表达也明显下降,表明KLF4介导TGF-β1对TβRI表达的诱导作用。 另外,将KLF4腺病毒表达载体Ad-KLF4感染VSMC,观察强制表达KLF4对TβRI和VSMC分化标志基因表达的影响。RT-PCR和Western blot分析证实,在KLF4过表达的VSMC中,TβRI表达明显高于空载体对照组,与此同时,分化标志基因SM22α和SMα-actin的表达也显著升高。 2. TGF-β1通过激活Smad和p38 MAPK信号通路诱导KLF4磷酸化和KLF4与Smad2/3相互作用 TGF-β1通过与VSMC上的相应受体相互作用而触发细胞信号的跨膜转导,进而活化Smad信号通路而激活相关基因表达。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)级联反应是胞内信号进行交互作用的重要信号转导通路。在上述阐明KLF4通过TβRI介导TGF-β诱导VSMC分化的基础上,本部分实验探讨TGF-β1对Smad和MAPK信号途径的影响,以期阐明TGF-β1诱导KLF4活化和促进细胞分化的信号转导机制。

2.1 TGF-β1通过激活Smad和p38 MAPK信号途径诱导KLF4磷酸化 VSMC经TGF-β1(2 ng/ml)刺激5、10、20、40 min,用磷酸化丝氨酸抗体对细胞裂解液进行免疫沉淀后检测磷酸化KLF4的水平。结果显示,随着TGF-β1刺激时间的延长,磷酸化型KLF4水平逐渐升高,在TGF-β1刺激20~40 min内,其磷酸化水平增加2倍;同时,TGF-β1刺激后,磷酸化型Smad2(p-Smad2)、Smad3(p-Smad3)和p38 MAPK(p-p38)水平也显著升高。 分别以TβRI特异性抑制剂SB431542、p38特异性抑制剂SB203580和ERK特异性抑制剂PD98059处理VSMC,特异性阻断Smad、p38或ERK信号通路的活化后,再以2 寻找更多 ng/ml的TGF-β1刺激细胞40 min。Western blot结果显示,SB431542或SB203580预处理细胞可显著抑制KLF4磷酸化,而PD98059对KLF4磷酸化无明显影响。用靶向Smad2、Smad3或p38 MAPK的siRNA敲低内源性Smad2、Smad3或p38 MAPK表达后,TGF-β1对KLF4磷酸化不再产生明显影响。证明TGF-β1诱导的KLF4磷酸化依赖于Smad和p38 MAPK信号途径的激活。 2.2 TGF-β1通过诱导KLF4磷酸化而促进KLF4与Smad2/3相互作用 免疫共沉淀分析结果显示,VSMC被TGF-β1处理后,KLF4与Smad2/3相互作用形成的复合物明显增加。VSMC在TGF-β1(2 ng/ml)刺激5、10、20、40 min后,随着刺激时间的延长,KLF4与Smad2/3的结合明显增加,交互免疫沉淀也得到相似的结果。表明,TGF-β1能显著促进KLF4与Smad2/3的相互作用,并具有明显的时效关系。 为了检查KLF4磷酸化是否影响其与Smad2/3的相互作用,以SB431542、SB203580和PD98059处理VSMC,特异性阻断Smad、p38或ERK信号通路的活化后,再以2 ng/ml TGF-β1刺激细胞40 min。免疫共沉淀分析结果显示,在SB431542和SB203580预孵育的VSMC中,KLF4与Smad2/3的相互作用明显降低,交互免疫沉淀得到相似的结果。用靶向Smad2、Smad3或p38 MAPK的siRNA敲低内源性Smad2、Smad3或p38 MAPK表达后,TGF-β1对KLF4与Smad2/3的相互作用不再产生明显影响。上述结果表明,TGF-β1通过Smad和p38 MAPK信号途径诱导KLF4发生磷酸化修饰,而磷酸化型KLF4与Smad2/3的结合活性明显增加。 KLF4磷酸化位点定点突变实验证明,转染KLF4磷酸化位点(S470A)突变体的细胞再用TGF-β1处理时,KLF4的磷酸化水平明显降低,KLF4与Smad2/3的相互作用较对照组(转染野生型KLF4表达载体)降低。这些结果进一步提示,TGF-β1通过诱导KLF4磷酸化而促进KLF4与Smad2/3之间的相互作用。 2.

86),这说明了MD模拟的必要性。而且,结果清楚地显示出疏水残基Val39、Val47、Ile60、Phel07、Asnl12、Metl57和Ile168在黄酮化合物与CK2结合中起主要作用,并且确定了影响生物活性的重要结构因素。基于受体-配体相互作用机制的能量和结构分析,我们设计出了一系列的新型分子并且通过综合性模拟研究验证了它们具有较高的抑制活性。我们希望此项研究工作能够成为促进新型有效靶向CK2抑制剂研发的一个范例。蛋白激酶CK2和PIM1都属于丝氨酸/苏氨酸激酶,并且具有相似的ATP结合位点,这说明大量的分子能够同时抑制这两种激酶。但是最近研究发现,两个结构相似的分子对CK2和PIM1具有不同的抑制活性,因而推测它们对这两种靶点可能具有不同的选择性机理。在论文的第四章,我们采用系统综合的计算模拟方法对两个小分子与两个蛋白质构成的四个复合体系进行详细的研究。我们采用IFD对接方法得到了复合物的起始结构,接着进行MD模拟研究,自由能计算和分解。分子水平上的比较分析使我们对选择性机理有了较透彻的了解。计算结果显示CK2中残基Val65、Phel12和Val115比PIM1中的对应残基Ala33、Leu88和Pro91与小分子1形成更强的van

der Waals作用力,使得小分子1对CK2具有较高的选择性。CK2中残基Val65、Phel12和Val115的疏水性强于PIM1中对应残基Ala33、Leu88和Pro91恰好证实了上述现象。同样,能量和结构分析也揭示了PIM1中残基Lys35、Glu57和Asp154比CK2中对应残基Lys67、Glu80和Asp174与小分子2形成了更强的氢键作用力,这说明了小分子2对PIM1具有较好的选择性。这主要归因于小分子2中三唑酮与PIM1能够形成强于CK2的氢键作用力。这项计算研究工作提供的数据信息为配体的选择性机理提供了价值性依据。
目的:本实验主要研究隐丹参酮对丝/苏氨酸蛋白激酶活性的影响及其在抑制肝癌细胞株中生长的作用。方法:Western印迹检测隐丹参酮在Hep 很少 G2细胞对丝/苏氨酸蛋白激酶磷酸化的影响以及联合哺乳动物雷帕霉素靶蛋白的抑制剂PP242后检测其凋亡标志物c-Parp的表达、以及丝/苏氨酸蛋白激酶的激活途径。CCK-8法检测隐丹参酮与丝/苏氨酸蛋白激酶抑制剂MK2206或哺乳动物雷帕霉素靶蛋白的抑制剂PP242联合用药对Hep G2的生长抑制作用。结果:1.隐丹参酮增强Hep G2细胞中丝/苏氨酸蛋白激酶的磷酸化。2.抑制丝/苏氨酸蛋白激酶的反馈激活增强隐丹参酮对Hep G2细胞的生长抑制作用,结果发现MK2206明显增强了隐丹参酮对Hep G2细胞的生长抑制作用。3.隐丹参酮对丝/苏氨酸蛋白激酶磷酸化的增强作用依赖于哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物2活性,结果发现PP242能够抑制隐丹参酮对丝/苏氨酸蛋白激酶磷酸化的增强作用,证明隐丹参酮对丝/苏氨酸蛋白激酶磷酸化的增强作用依赖于哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物2活性。4.抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物2活性增强隐丹参酮对Hep

selleckchem G2细胞的生长抑制作用,结果发现联合使用PP242明显增强了隐丹参酮对Hep G2细胞的生长抑制作用。5.抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物2活性增强隐丹参酮对Hep 那个 G2细胞的凋亡诱导效应,由于丝/苏氨酸蛋白激酶信号通路在肿瘤细胞存活中发挥重要作用,说明抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物2活性能够增强隐丹参酮对Hep G2细胞的凋亡诱导效应。结论:我们的研究证明在Hep G2细胞中,AKT丝/苏氨酸蛋白激酶依赖哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物2能够激活p-AKT473位点的磷酸化,通过抑制丝/苏氨酸蛋白激酶及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物2都能够提高隐丹参酮在Hep G2细胞中的生长抑制作用,为隐丹参酮肿瘤治疗的临床联合用药提供了理论基础。
一、研究背景:缺血再灌注室性心律失常是心梗采用溶栓或冠状动脉介入治疗术后血管再通所致的常见临床现象,其发生率较高,也是引起心血管临床事件的主要原因之一,因此怎样减少缺血再灌注所诱发的室性心律失常已成为目前临床心血管病介入治疗以及防治缺血性心脏病的研究热点。整合素连接激酶(integrin-linked kinase,I L K)是在多类组织、细胞中普遍表达的介导胞外信号分子调节胞内结构与功能的关键蛋白激酶,参与了细胞增殖、分化、迁移以及血管再生等多种细胞生物学功能的调节。大量研究表明ILK在心脏结构、功能的调节以及心脏疾病(如心室肥厚、心肌病、心梗等)的发生发展中具有重要的调节作用。然而,ILK是否在缺血再灌注室性心律失常的发生中发挥调节作用及可能的调控机制如何,目前未见相关的报道。既往有大量研究证实缝隙连接蛋白43(connexin

43,C x 4 3)在心律失常的发生中具有重要作用,上调Cx43的表达、促进其磷酸化以及抑制其重塑均可减少再灌注心律失常的产生。然而,下调心肌ILK表达可引起Cx43的表达的下降,提示ILK可能参与调节Cx43信号分子介导的相关功能。近年有报道,Akt可通过磷酸化Cx43-373位点,稳定Cx43在闰盘处的分布,抑制Cx43重塑,然而ILK作为Akt的上游信号分子,可直接或间接磷酸化Akt-473位点,调节Akt的活性。因此,我们推测I L K可通过Akt调控Cx43靶点间接预防再灌注室性心律失常的发生。为此我们采用缺血再灌注心律失常模型研究ILK在大鼠缺血再灌注室性心律失常中的作用以及可能的调控机制,重点研究Cx43在ILK调节再灌注室性心律失常中的作用。二、研究方案及重要方法1.ILK在心脏缺血再灌注室性心律失常中的作用为研究ILK在缺血再灌注心律失常中的作用,我们采用Langendorff系统构建离体心脏缺血再灌注心律失常模型,给予ILK激动剂LPTP、抑制剂Cpd22预处理心脏,分为Sham组、I/R组、I/R+Cpd22组、I/R+LPTP组、I/R+Cpd22+LPTP组,记录并观察比较各组心律失常发生情况。2.明确C x 43在ILK改善心脏再灌注室性心律失常中的作用为研究Cx43在ILK改善心脏再灌注室性心律失常中的作用,我们将上述5组心脏组织分别提取组织蛋白,采用蛋白印迹法检测C x 43蛋白表达水平的改变,同时通过免疫荧光法检测Cx43的分布。3.

5、15、30、60、120 mg/L)能浓度依赖性地抑制HSCs增殖及I型α1前胶原(procollagen, type I, alpha1,Col Iα1)、III型α1前胶原(procollagen, type III, alpha1,Col IIIα1)、Col I和Col III的转录、合成和分泌。 4. PAE在转录和合成水平抑制HSCs中Smad3的表达 RT-PCR和Western blotting显示PAE对TGFβ1-Smads信号转导通路中的Smad2、Smad4和Smad7无明显作用,而对Smad3具有浓度依赖型性的抑制。提示,抑制Smad3转录和合成可能是PAE抗血吸虫病肝纤维化的机制之一。 结论: 1. TGFβ1可促进小鼠日本血吸虫病肝纤维化; 2.早期给予PAE可预防小鼠日本血吸虫病肝肉芽肿、肝纤维化的形成和TGFβ1表达; 3. SEA可刺激PMs分泌TGFβ1,后者可促进HSCs增殖和胶原分泌; 4. PAE预防血吸虫病肝纤维化可能与下述机制有关 a)抑制PMs分泌TGFβ1 b)抑制HSCs的增殖 c)通过抑制Smad3 mRNA的表达抑制HSCs产生胶原 KU-57788研究购买 总之,在血吸虫病肝纤维化中,SEA能刺激巨噬细胞产生TGFβ1,后者可使HSCs增殖和分泌胶原。PAE通过抑制巨噬细胞分泌TGFβ1、HSCs的增殖、Smad3的转录和合成而最终抑制胶原的产生,发挥其抗纤维化的作用。以上研究结果将为PAE开发成治疗血吸虫病肝纤维化中药新药提供了实验依据。
TGFβ家族的信号转导由TGFβ受体ALK4或ALK7介导,在脊椎动物胚胎的中胚层和内胚层诱导以及神经外胚层的前-后轴线分化中起着重要作用。母体来源的这些TGFβ信号在胚胎发育的什么时期被激活、如何影响胚胎的发育,一直没有明确的答案。

SB-431542是一种小分子化合物,在培养的哺乳动物细胞中的实验表明,它能够特异性地阻断ALK4、ALK5、ALK7介导的TGFβ信号的转导。本研究证明,SB-431542在斑马鱼体内同样可以特异性地抑制ALK4、ALK7介导的TGFβ信号。主要证据包括:首先,SB-431542处理的斑马鱼胚胎在表型上与Nodal缺失的突变体的表型类似;其次,SB-431542可以抑制响应Activin/TGFβ的荧光酶报告系统在斑马鱼体内的表达,而对响应ΒΜP的荧光酶报告系统在斑马鱼体内的表达则无抑制作用;第三,SB-431542可以抑制在斑马鱼体内过量表达activin或sqt对中胚层标记基因的诱导作用,但不抑制过量表达bmp2对腹部外胚层标记基因gata2的诱导作用;第四,在SB-431542存在的情况下,过量表达smad3a和smad3b引起的gsc的表达增强受到抑制;第五,SB-431542处理导致的表现型可以被持续激活型的Smad2蛋白所逆转。

为了确定斑马鱼中母源TGFβ信号的激活时间,本研究用50μM SB-431542在中囊胚过渡期前(即合子基因开始表达之前)的不同时期处理胚胎,随后观察胚胎形态和检测分子标记的变化。结果说明,诱导中胚层发育的母源TGFβ信号在受精后就开始激活,并在合子基因表达之前不断地传导其信号。当用SB-431542短时间处理卵裂期胚胎,24小时的胚胎仍表现出中轴组织发育缺陷,说明合子基因表达前激活的母源TGFβ信号是胚胎正常发育所必不可少的。本实验还证明中囊胚过渡期前激活的母源TGFβ信号不足以保证胚胎的正常发育,其正常发育还需要中囊胚过渡期后激活的TGFβ信号。 确认细节 此外,本研究还从缺失Nodal信号的MZoep突变体、过量表达Nodal基因sqt的胚胎、以及野生型胚胎中提取mRNA,与斑马鱼基因芯片杂交,发现了许多受Nodal信号调控的基因,为深入研究Nodal信号调控胚胎发育的机理打下了基础。
研究背景及目的 什么 脓毒症(sepsis)是感染、严重创伤及大手术等多种应激状态时的常见并发症。近年随着滥用抗生素使耐药菌增多,介入性治疗及有创性监护增多,以及医院内感染的增多等因素,脓毒症死亡率居高不下,约28%～50%,合并休克及脏器功能不全时可达50%～70%,甚至很快死亡。儿科严重脓毒症和脓毒性休克(septic shock)至今仍处于高发病率、高病死率状态。2002年,国际儿科脓毒症共识会议专家组按严格科学的程序,首次在儿科界确定了脓毒症的相关概念[包括儿科全身炎症反应综合征、感染、脓毒症、严重脓毒症、脓毒性休克和多器官功能障碍综合征(MODS)]。经3年实践,2005年1月发表。严重脓毒症由于病死率高(是美国儿童患病及死亡的主要原因之一)、治疗费用昂贵,已构成对人类健康的严重威胁和经济发展的巨大负担。 革兰阴性菌(G~-)感染是引起脓毒症的重要原因之一,其外膜的活性成分内毒素即脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)与宿主细胞膜上的模式识别受体模式识别受体TLR2和TLR4(toll-like

receptor,TLR)结合,启动一系列信号传导反应,引起多种细胞因子和炎症介质的表达和释放。众多实验研究证实前炎症细胞因子TNF-α(tumor necrosis factor-α)是脓毒症和脓毒性休克发病的重要介质,巨噬细胞是脓毒症TNF-α产生的主要来源。大量TNF-α的产生可引起多种细胞因子和炎症介质的过度表达和释放,诱发全身炎性反应,导致血管通透性增加、体液渗出和淋巴细胞移行到炎症部位,影响到心血管、呼吸、血液等多系统的功能。其中,肺是最普遍受影响的器官,脓毒症病人经常发展为急性肺损伤(acute lung injury,ALI)或者急性呼吸窘迫综合症(acute respiratory distress syndrome,ARDS)。肺功能损伤使脓毒症病人必然伴随低氧的病理状态。低氧、低糖、高水平的炎症细胞因子和活性氧代谢产物等是炎症和损伤组织微环境的特点。缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor 1,HIF-1)是哺乳动物和人体内细胞存在着一类介导低氧适应性反应的转录因子,它的氧调节亚单位HIF-1α仅在低氧状态表达,能激活许多低氧反应性基因(hypoxia responsive genes,HRG)的表达。尽管低氧与脓毒症相关,对TNF-α的产生是否与脓毒症低氧过程及HIF-1α诱导相关,这些问题只有很少的研究。 p38 MAPK(mitogen activated protein kinase)被认为是“应激诱导”的MAPK,可在转录和转录后水平调控TNF-α表达,在LPS诱导的TNF-α信号传导通路中占据重要地位,抑制p38通路有希望成为炎症性疾病的新的治疗策略。以SB203580为代表的吡啶异咪哒唑化合物是p38 MAPK的特异性抑制剂,但是对其体内应用效果却仍然存在争议。对氧浓度是否参与p38激活的报道较少见。 本研究通过培养小鼠巨噬细胞RAW264.

5%、48%。NALP3-siRNA组IL-1β mRNA表达降低23%、ASC-siRNA组降低了39%。ELISA结果显示NALP3-siRNA组IL-1β和IL-18的表达分别减少27.7%、21%，ASC-siRNA组IL-1β和IL-18的表达分别减少44.1%、40.1%。Western

AZD8931分子量 blotting结果发现p38磷酸化水平与对照组无明显差异。 （5） Caspase-1抑制剂能降低IL-1β、IL-18的表达，分别降低41.9%和37.2%；p38抑制剂使IL-1β、IL-18表达降低，分别降低29.6%和37.8%，NALP3、ASC、Caspase-1及IL-1β的mRNA表达分别减少23%、31%、13%和23%。 结论: （1）pORF5质粒蛋白可通过激活NALP3炎性复合体诱导THP-1细胞分泌炎症因子IL-1β、IL-18。 （2）pORF5质粒蛋白激活的p38MAPK信号通路能够影响NALP3炎性复合体的激活。
胃癌是世界各地最为常见的恶性肿瘤之一，在我国，其发生率和死亡率占恶性肿瘤的第二位，侵袭和转移是导致胃癌患者死亡的主要原因。因此，深入探讨引起增加胃癌侵袭与转移的作用及机制,进一步抑制胃癌细胞的侵袭转移,对于胃癌的临床治疗与预后具有深远的意义。白细胞介素-1β（IL-1β）已被证实与胃腺癌的发生、发展密切相关，但其分子机制尚不清楚。p38蛋白激酶是丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）家族的主要成员之一，是调控IL-1β信号通路的主要激酶。因此，我们着眼于研究p38蛋白激酶在IL-1β介导的胃腺癌细胞侵袭和转移中的作用及其机制。目前尚未见相关文献报道。 目的：探讨IL-1β介导的p38蛋白激酶在胃腺癌细胞侵袭和转移中的作用，并从细胞水平、临床样本、动物水平三方面初步探讨其作用机制，旨在阐明其作用及机制并为胃腺癌患者寻找一种新的治疗方法提供良好的实验依据。 方法： 1、应用Western blot技术在胃腺癌细胞株中验证IL-1β是否能激活p38蛋白激酶； 2、应用RNA干扰技术(siRNA技术)结合p38信号途径特异性抑制剂SB202190和Transwell迁移侵袭实验检测IL-1β激活p38蛋白激酶对胃腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响；

3、应用siRNA技术结合p38信号途径特异性抑制剂SB202190和RT-PCR检测IL-1β激活p38蛋白激酶对胃腺癌细胞中MMP2、MMP9mRNA表达的影响； 4、应用siRNA技术，通过转染MMP2siRNA、MMP9siRNA以及MMP2/MMP9siRNA和应用MMP2/9抑制剂BiPS进一步检测IL-1β增加胃腺癌细胞迁移和侵袭的可能机制是否涉及MMP2和MMP9； 无 5、应用免疫组化技术检测人胃腺癌组织样本中磷酸化p38（p-p38）的表达及其表达强度与IL-1β、MMP2、MMP9表达强度之间的相关性； 6、应用siRNA技术结合动物实验、RT-PCR和免疫组化技术检测敲减p38再接受IL-1β刺激前后裸鼠胃癌肺转移结节数及裸鼠胃癌肺转移组织中p38/p-p38、MMP2、MMP9mRNA和蛋白质的表达。 结果： 1、IL-1β的刺激，可激活胃腺癌细胞AGS和MKN-45的p38蛋白激酶Western blot结果显示：在IL-1β刺激后30min，两株胃腺癌细胞AGS和MKN-45中的p38蛋白激酶均可被IL-1β激活，发生磷酸化；p38抑制剂SB202190预作用于细胞3h后再用IL-1β刺激，

p38蛋白激酶磷酸化则被抑制，表明IL-1β激活p38蛋白激酶具有较强的特异性。 2、IL-1β激活p38蛋白激酶可增加胃腺癌细胞AGS和MKN-45迁移和侵袭能力Transwell测定结果表明：接受IL-1β刺激后，胃腺癌细胞AGS和MKN-45迁移和侵袭作用增强，与未接受刺激的细胞相比，差异具有统计学意义(p﹤0.05)；转染p38siRNA或用p38抑制剂SB202190预处理细胞，则胃腺癌细胞上述作用明显减弱，表明IL-1β增加胃腺癌细胞迁移和侵袭的作用是通过激活p38蛋白激酶。 3、IL-1β激活p38蛋白激酶通过上调MMP2和MMP9的表达增加胃腺癌细胞迁移和侵袭RT-PCR测定结果表明，IL-1β刺激后，胃腺癌AGS和MKN-45细胞中的MMP2和MMP9的mRNA表达增加，与未接受刺激的细胞相比，差异具有统计学意义(p﹤0.05)；转染p38siRNA和用p38抑制剂SB202190预处理的胃腺癌细胞接受IL-1β刺激后，MMP2和MMP9的mRNA表达降低。上述结果初步表明IL-1β激活p38蛋白激酶增加胃腺癌细胞迁移和侵袭的机制涉及上调MMP2和MMP9。 Tyrphostin B42供应商 4、Transwell测定结果表明：与siRNA阴性对照转染组比较，MMP2siRNA转染组和MMP9siRNA转染组以及MMP2/MMP9抑制剂BiPS预处理组的胃腺癌细胞接受IL-1β刺激后迁移和侵袭能力明显减弱，结果进一步表明：IL-1β增加胃腺癌细胞迁移和侵袭的机制涉及上调MMP2和MMP9。 5、免疫组化结果表明：在105例测定的胃腺癌样本中，与配对非癌组织样本比较，53例胃腺癌组织(50.48%)过表达磷酸化的p38(p-p38)。p-p38的过表达与患者的年龄、性别、肿瘤大小、组织学类型和肿瘤分化程度无关(p﹥0.05)，但与淋巴结转移和肿瘤侵袭程度（至浆膜外）密切相关(p﹤0.05)。同时，p38的过表达与IL-1β, MMP2, MMP9的高表达具有显著的相关性(r=0.72, p﹤0.01; r=0.63, p﹤0.01; r=0.58, p﹤0.

4),然后在formalin注射后的第1、2、3、4天分别重复给予同样剂量的药物。各组均随机选择6只大鼠在formalin注射前1天,注射后2小时、1天、3天、7天、10天、2周、3周和4周进行连续的痛行为学观察(包括formalin注射侧和对侧);另外从各组动物中再随机选出24只在formalin注射后2小时、1天、7天、2周、3周和4周共6个时间点(每个时间点4只)进行痛行为(包括formalin注射侧及对侧)观察,并分别进行脊髓腰膨大部位小胶质细胞激活标志物OX-42的免疫组化检测。此后分别对所得数据进行图像分析及统计学处理。

查看更多 行为学观察结果显示,大鼠足背给予formalin(5%,50μl)后,动物即刻出现痛行为反应,表现为PWL(Paw Withdraw Latency)的缩短,2小时即出现了痛敏反应的高峰并持续到在formalin注射后10天,之后恢复正常。在formalin注射后第3周再次出现痛觉敏感,第4周时恢复正常。在外周应用CPCCOEt(100 nmol)或MPEP(50 nmol)之后,两个注药组的行为测试数据显示PWL延长,分别与对照组相比,均在formalin注射后2小时、1天、3天具有显著性差异(P＜0.05)。 免疫组化结果显示,大鼠足背给予formalin后,脊髓背角小胶质细胞在2小时后表达增加,高峰出现在7天,之后逐渐减弱。在外周应用CPCCOEt(100nmol)MPEP(50nmol)之后,小胶质细胞OX-42阳性表达明显降低。在2小时、7天OX-42阳性表达与对照组相比均有显著性差异(P＜0.05)。 实验结果提示:1.formalin外周注射可形成长时程痛敏,持续时间超过2周,与此同时,观察到脊髓背角小胶质细胞的活化增强,提示这可能是导致长时程痛敏的主要原因之一;2.外周局部注射第一组代谢型谷氨酸受体拮抗剂,可阻断或减弱了formalin导致的长时程痛敏和脊髓背角小胶质细胞的激活,提示这类受体参与了formalin引起的外周痛感受器的激活。 第二部分脊髓第一组代谢型谷氨酸受体在formalin引起的长时程痛敏和脊髓小胶质细胞活化中的作用 本研究第一部分的观察证实,外周局部给予第一组代谢型谷氨酸受体拮抗剂可以有效抑制外周注射formalin引起的长时程痛敏和脊髓小胶质细胞的活化。那么第一组代谢型谷氨酸受体是否在脊髓水平也参与了formalin外周注射所引起的长时程痛敏反应和脊髓小胶质细胞的活化呢?本部分实验利用上述的痛模型结合鞘内注射第一组代谢型谷氨酸受体拮抗剂对此加以证实。

实验在Sprague-Dawley雄性大鼠(100-120g)进行,同样进行行为学和免疫组化两项观察。54只大鼠分为三组,分别在formalin注射前15分钟预先鞘内给予第一组代谢型谷氨酸受体的拮抗剂CPCCOEt(100 nmol)、MPEP(50 nmol)或者注入HEPES Buffer作为对照(100 mM,pH7.4),然后在formalin注射后的第1、2、3、4天分别重复给予同样剂量的药物。各组均随机选择6只大鼠在formalin注射前1天,注射后2小时、1天、3天、7天、2周、3周和4周进行连续痛行为学观察(包括formalin注射侧和对侧),另外从各组动物中随机再随机选出12只进行脊髓腰膨大部位小胶质细胞激活标志物OX-42的免疫组化检测,但只设formalin注射后2小时、7天和4周共3个时间点(每个时间点4只)进行。此后对所得数据进行图像分析及统计学处理。 Doramapimod半抑制浓度 LY2157299体外 行为学观察结果显示,对照组动物可出现痛行为反应,表现为PWL的缩短,同样在2小时出现痛敏反应的高峰,并持续到7天。在鞘内分别应用CPCCOEt(100

nmol)或MPEP(50 nmol)之后,PWL明显延长;CPCCOEt可以有效抑制formalin注射后2小时、1天、3天和7天的痛敏,而MPEP则只抑制了formalin注射后2小时和1天的PWL缩短。免疫组化结果显示,鞘内应用CPCCOEt(100 nmol)或MPEP(50 nmol)之后,formalin注射后2小时和7天的小胶质细胞OX-42阳性表达明显降低,与对照组相比均有显著性差异(P＜0.05)。 实验结果提示:1.脊髓第一组代谢型谷氨酸受体拮抗剂可以抑制formalin引起的长时程痛敏和脊髓小胶质细胞的活化;2.在脊髓水平第一组代谢型谷氨酸受体参与了formalin引起的长时程痛敏和脊髓小胶质细胞的活化。 第三部分第一组代谢型谷氨酸受体参与formalin引起的长时程痛敏和小胶质细胞活化过程的机制探讨—p38MAPK途径分析 丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)是一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族,它可以介导细胞外刺激信号进入细胞,引发转录和翻译水平的反应。MAPK家族主要包括ERK、p38MAPK、和c-Jun(JNK/SAPK)。p38作为MAPK的家族成员可以调控与细胞损伤(包括炎症因子、热休克、紫外线照射和缺血等)相关的一些病理过程。大量的研究证实,在许多疼痛模型中都有p38MAPK的活化即磷酸化过程,并且磷酸化的p38MAPK主要位于小胶质细胞。这些结果提示,小胶质细胞在参与疼痛的过程可能主要是通过p38MAPK通路发挥作用。本实验在前面二部分实验结果的基础上,观察第一组代谢型谷氨酸受体是否通过p38MAPK信号途径参与长时程痛敏和小胶质细胞的活化。 实验在Sprague-Dawley雄性大鼠(100-120g)进行。首先观察formalin外周注射后脊髓p38MAPK的磷酸化过程。在formalin注射前、注射后5分钟、15分钟、60分钟、1天、3天、7天、2周和4周,分别取大鼠腰膨大组织进行匀浆,利用Western blot技术观察磷酸化p38MAPK(P-p38)的表达,用以反映p38MAPK的活化情况。结果显示,如果以基础状态的P-p38水平作为100%,注射formalin后各时间点的P-p38的表达分别为303.78%、182.56%、101.68%、273.84%、101.