4),然后在formalin注射后的第1、2、3、4天分别重复给予同样剂量的药物。各组均随机选择6只大鼠在formalin注射前1天,注射后2小时、1天、3天、7天、10天、2周、3周和4周进行连续的痛行为学观察(包括formalin注射侧和对侧);另外从各组动物中再随机选出24只在formalin注射后2小时、1天、7天、2周、3周和4周共6个时间点(每个时间点4只)进行痛行为(包括formalin注射侧及对侧)观察,并分别进行脊髓腰膨大部位小胶质细胞激活标志物OX-42的免疫组化检测。此后分别对所得数据进行图像分析及统计学处理。
查看更多 行为学观察结果显示,大鼠足背给予formalin(5%,50μl)后,动物即刻出现痛行为反应,表现为PWL(Paw Withdraw Latency)的缩短,2小时即出现了痛敏反应的高峰并持续到在formalin注射后10天,之后恢复正常。在formalin注射后第3周再次出现痛觉敏感,第4周时恢复正常。在外周应用CPCCOEt(100 nmol)或MPEP(50 nmol)之后,两个注药组的行为测试数据显示PWL延长,分别与对照组相比,均在formalin注射后2小时、1天、3天具有显著性差异(P＜0.05)。 免疫组化结果显示,大鼠足背给予formalin后,脊髓背角小胶质细胞在2小时后表达增加,高峰出现在7天,之后逐渐减弱。在外周应用CPCCOEt(100nmol)MPEP(50nmol)之后,小胶质细胞OX-42阳性表达明显降低。在2小时、7天OX-42阳性表达与对照组相比均有显著性差异(P＜0.05)。 实验结果提示:1.formalin外周注射可形成长时程痛敏,持续时间超过2周,与此同时,观察到脊髓背角小胶质细胞的活化增强,提示这可能是导致长时程痛敏的主要原因之一;2.外周局部注射第一组代谢型谷氨酸受体拮抗剂,可阻断或减弱了formalin导致的长时程痛敏和脊髓背角小胶质细胞的激活,提示这类受体参与了formalin引起的外周痛感受器的激活。 第二部分脊髓第一组代谢型谷氨酸受体在formalin引起的长时程痛敏和脊髓小胶质细胞活化中的作用 本研究第一部分的观察证实,外周局部给予第一组代谢型谷氨酸受体拮抗剂可以有效抑制外周注射formalin引起的长时程痛敏和脊髓小胶质细胞的活化。那么第一组代谢型谷氨酸受体是否在脊髓水平也参与了formalin外周注射所引起的长时程痛敏反应和脊髓小胶质细胞的活化呢?本部分实验利用上述的痛模型结合鞘内注射第一组代谢型谷氨酸受体拮抗剂对此加以证实。
实验在Sprague-Dawley雄性大鼠(100-120g)进行,同样进行行为学和免疫组化两项观察。54只大鼠分为三组,分别在formalin注射前15分钟预先鞘内给予第一组代谢型谷氨酸受体的拮抗剂CPCCOEt(100 nmol)、MPEP(50 nmol)或者注入HEPES Buffer作为对照(100 mM,pH7.4),然后在formalin注射后的第1、2、3、4天分别重复给予同样剂量的药物。各组均随机选择6只大鼠在formalin注射前1天,注射后2小时、1天、3天、7天、2周、3周和4周进行连续痛行为学观察(包括formalin注射侧和对侧),另外从各组动物中随机再随机选出12只进行脊髓腰膨大部位小胶质细胞激活标志物OX-42的免疫组化检测,但只设formalin注射后2小时、7天和4周共3个时间点(每个时间点4只)进行。此后对所得数据进行图像分析及统计学处理。 Doramapimod半抑制浓度 LY2157299体外 行为学观察结果显示,对照组动物可出现痛行为反应,表现为PWL的缩短,同样在2小时出现痛敏反应的高峰,并持续到7天。在鞘内分别应用CPCCOEt(100
nmol)或MPEP(50 nmol)之后,PWL明显延长;CPCCOEt可以有效抑制formalin注射后2小时、1天、3天和7天的痛敏,而MPEP则只抑制了formalin注射后2小时和1天的PWL缩短。免疫组化结果显示,鞘内应用CPCCOEt(100 nmol)或MPEP(50 nmol)之后,formalin注射后2小时和7天的小胶质细胞OX-42阳性表达明显降低,与对照组相比均有显著性差异(P＜0.05)。 实验结果提示:1.脊髓第一组代谢型谷氨酸受体拮抗剂可以抑制formalin引起的长时程痛敏和脊髓小胶质细胞的活化;2.在脊髓水平第一组代谢型谷氨酸受体参与了formalin引起的长时程痛敏和脊髓小胶质细胞的活化。 第三部分第一组代谢型谷氨酸受体参与formalin引起的长时程痛敏和小胶质细胞活化过程的机制探讨—p38MAPK途径分析 丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)是一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族,它可以介导细胞外刺激信号进入细胞,引发转录和翻译水平的反应。MAPK家族主要包括ERK、p38MAPK、和c-Jun(JNK/SAPK)。p38作为MAPK的家族成员可以调控与细胞损伤(包括炎症因子、热休克、紫外线照射和缺血等)相关的一些病理过程。大量的研究证实,在许多疼痛模型中都有p38MAPK的活化即磷酸化过程,并且磷酸化的p38MAPK主要位于小胶质细胞。这些结果提示,小胶质细胞在参与疼痛的过程可能主要是通过p38MAPK通路发挥作用。本实验在前面二部分实验结果的基础上,观察第一组代谢型谷氨酸受体是否通过p38MAPK信号途径参与长时程痛敏和小胶质细胞的活化。 实验在Sprague-Dawley雄性大鼠(100-120g)进行。首先观察formalin外周注射后脊髓p38MAPK的磷酸化过程。在formalin注射前、注射后5分钟、15分钟、60分钟、1天、3天、7天、2周和4周,分别取大鼠腰膨大组织进行匀浆,利用Western blot技术观察磷酸化p38MAPK(P-p38)的表达,用以反映p38MAPK的活化情况。结果显示,如果以基础状态的P-p38水平作为100%,注射formalin后各时间点的P-p38的表达分别为303.78%、182.56%、101.68%、273.84%、101.