0和4.0mg·kg~(-1)可显著降低猪血清刺激后升高的Hyp值。组织病理学结果表明AGS-Ⅳ可明显的抑制猪血清诱导的肝纤维化,改善肝组织结构。
AGS-Ⅳ还可以缓解肝纤维化大鼠肝脏的氧化应激状态,降低肝脏丙二醛(malondiadehyde,MDA)的合成,增加超氧化物歧化酶(super oxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-px)等抗氧化酶的活性。鉴于TGF-β_1在肝纤维化中的重要作用,实验中观察了AGS-Ⅳ对猪血清诱导肝纤维化大鼠血清及肝脏组织中TGF-β_1表达的影响。免疫组织化学结果显示AGS-Ⅳ治疗后大鼠肝组织中TGF-β_1的表达显著降低,血清检测结果显示,AGS-Ⅳ可降低模型中升高的血清TGF-β_1水平。 2.AGS-Ⅳ对HSCs增殖、凋亡及胶原合成的影响和对TGF-β_1/Smads信号转导的影响 体外细胞实验观察了不同浓度AGS-Ⅳ(1.5、3.0、6.0、12.0、24.0 mg·L~(-1))对HSCs增殖、凋亡及胶原合成的影响。结果显示,AGS-Ⅳ呈浓度依赖性的抑制PDGF-BB刺激的HSCs增殖。并可增加sub-G_1 DNA含量,诱导HSCs凋亡,且增加caspase-3的活性。AGS-Ⅳ可显著抑制TGF-β_1诱导的HSCs胶原合成。为进一步研究AGS-Ⅳ对Smads信号转导的调节作用,实验中采用western blot法分析了Smad3和Smads7蛋白的表达,结果显示,TGF-β_1刺激HSCs后,Smad3表达水平显著升高,在给予AGS-Ⅳ处理后,随浓度增加(6.0、12.0、24.0 SB431542小白鼠 Akt抑制剂 mg·L~(-1)),可降低Smad3的表达水平。同时,AGS-Ⅳ可使TGF-β_1刺激后升高的Smad7的表达水平进一步升高。 3.PGE_2-EP_2-cAMP信号转导在HSCs胶原合成中的作用及AGS-Ⅳ对其影响 为检测PGE_2水平降低及EP_2表达改变对猪血清诱导肝纤维化大鼠的影响,实验中给予选择性COX-2抑制剂塞来昔布处理大鼠。病理学结果显示,塞来昔布可显著增加猪血清诱导的肝纤维化,值得注意的是,除了加重纤维化的形成外,塞来昔布还可使猪血清诱导肝纤维化大鼠肝脏出现炎性坏死。而其他各组均无肝组织坏死出现。而塞来昔布本身并不引起肝纤维化。实验中检测了血清肿瘤坏死因子-α(tumor
necrosis factor-α,TNF-α),白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)两种重要的炎性因子,猪血清及塞来昔布单独刺激对血清TNF-α和IL-1β水平无明显的影响,而塞来昔布可使猪血清诱导肝纤维化大鼠血清TNF-α和IL-1β显著升高。血清PGE_2水平的检测结果显示,猪血清刺激2周后,大鼠血清PGE_2水平显著升高,随着猪血清的持续刺激,血清PGE_2水平开始下降,至第8周时显著低于正常对照组。第8周时,塞来昔布处理后各组大鼠血清PGE_2水平均低于对照组,塞来昔布可使猪血清免疫后大鼠血清PGE_2的水平进一步降低,western 5FU blot结果显示,猪血清刺激8周后分离培养的大鼠HSCs中EP_2表达水平显著低于正常对照组大鼠HSCs。体外实验研究了PGE_2及EP_2受体激动剂ONO-AE1-259-01对HSCs胶原合成的影响,PGE_2(5,500nM)及ONO-AE1-259-01(1,100 nM)对TGF-β_1刺激的胶原合成具有显著的抑制作用,并可升高细胞内cAMP水平,实验中进一步观察了AGS-Ⅳ对PGE_2-EP_2-cAMP通路的影响,结果显示,AGS-Ⅳ可减少猪血清诱导肝纤维化大鼠血清PGE_2水平的降低,增加EP_2在HSCs中的表达,升高细胞内cAMP浓度。
结论 1.AGS-Ⅳ对猪血清诱导大鼠肝纤维化具有良好的保护作用 AGS-Ⅳ两个剂量对猪血清诱导肝纤维化大鼠肝细胞具有良好的保护作用,并改善肝组织病理改变,阻止肝纤维化的形成。AGS-Ⅳ可改善猪血清诱导肝纤维化大鼠肝脏氧化应激状态,并可以抑制模型组大鼠HSCs的胶原合成及增殖。 2.AGS-Ⅳ可抑制HSCs的增殖、诱导HSCs凋亡,并通过调节TGFβ/Smads信号通路抑制其胶原合成 AGS-Ⅳ1.5～24.0 mg·L~(-1)对PDGF-BB刺激的HSCs增殖具有浓度依赖性的抑制作用;AGS-Ⅳ具有诱导HSCs凋亡的作用,其机制可能是与增加caspase-3活性有关;AGS-Ⅳ1.5～24.0 mg·L~(-1)对TGF-β1诱导的HSCs胶原合成具有浓度依赖性抑制作用。AGS-Ⅳ可降低Smad3表达降低,而升高抑制型Smad7的表达,提示AGS-Ⅳ可能是通过TGFβ_1/Smad信号转导的调节对HSCs胶原合成发挥抑制作用。 3.PGE_2-EP_2-cAMP通路在猪血清诱导大鼠肝纤维化形成及HSCs胶原合成中发挥重要作用 猪血清诱导肝纤维化大鼠中,血清PGE_2水平呈下降趋势,EP_2表达降低,给予COX-2抑制剂celecoxib处理后,血清PGE_2进一步降低,EP_2蛋白表达降低,而纤维化程度增加,表明PGE_2-EP_2在猪血清诱导大鼠肝纤维化中可能发挥保护作用,体外研究表明,PGE_2和选择性的EP_2受体激动剂均可抑制TGF-β_1诱导的HSCs胶原合成,增加细胞内cAMP浓度,提示PGE_2-EP_2-cAMP信号转导参与了TGF-β_1诱导HSCs胶原合成。 4.