4)洗涤3次×5min；除去PBS液,每张切片加50uL生物素标记的羊抗小鼠二抗,室温下孵育20min,孵育后PBS冲洗3次,每次5min；甩去PBS液,滴加50uL链霉菌抗生物素-辣根过氧化物酶溶液,室温孵育40min,PBS冲洗5min×3次；DAB显色3-5min,显微镜下控制,自来水冲10min-15min终止反应,苏木素复染约3min,梯度酒精脱水和二甲苯透明后中性树胶封片。结果判断由两个独立的病理医生无相关样本临床资料的信息分析,出现结果不一致时重新判片,直至达成一致意见。结果判定的标准：以细胞浆出现棕黄色颗粒的细胞定为阳性细胞,每张切片采用盲法随机观察10个高倍镜视野(×400),结果采用半定量计分方法,根据细胞染色强度(A)和染色细胞所占的比例(B)两者乘积来判定。
3、采用RT-PCR方法检测膀胱尿路上皮癌组织及其对应的癌旁正常膀胱组织由Nodal mRNA表达水平,并分析Nodal mRNA表达与膀胱尿路上皮癌病理分级及临床分期的关系 GenBank上查找NodalmRNA序列,并应用在线引物设计软件Premier Primer5.0和Oligo6设计相关引物。引物均由上海英骏生物技术有限公司合成。按照Trizol Reagent说明书将总RNA提取后,按70℃5min,37℃5min,42℃60min,70℃10min进行反转录合成cDNA,加4uL反转录DNA产物于25uLPCR反应体系中,94℃5min,94℃30s,55℃45s,72℃1min,循环36次。选择β-actin为PCR内参。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳和凝胶成像系统分析后,计算待测指标与B-actin A值的比值。应用SPSS13.0软件进行统计学分析比较膀胱尿路上皮癌生物学行为与Nodal mRNA表达之间的关系,PⅡ级(PⅠ级(PT1期>Ta期(P均
目的：近年来，有研究表明GDF-15可以诱导外周单个核细胞（PBMC）中Foxp3转录水平的的增加，Foxp3是调节性T细胞（Tregs）的标志性分子，那么GDF-15对Tregs分化发育及功能有何影响呢？因此本研究拟探讨GDF-15在体外诱导人Na ve CD4~+T细胞向Tregs分化过程中的作用及其影响；通过临床样本观察结直肠癌患者外周血CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞比例和血清中GDF-15表达水平的相关性；初步探讨GDF-15在iTregs分化中的分子作用机制。 GW-572016数据表 方法：本课题设计了以下三个方面实验：1、GDF-15诱导iTregs分化及其功能的鉴定。通过采取免疫磁珠法分选Na ve CD4~+T细胞，经GDF-15刺激后，通过Real-time PCR、流式细胞术检测标志性分子Foxp3、CD25，GITR，CD103等的表达，通过Real-time PCR、ELISA检测抑制性细胞因子IL-10和TGF-β等的分泌从而鉴定GDF-15诱导的iTregs表型，进一步用BrdU掺入和CFSE检测诱导的iTregs对效应CD4~+T细胞增殖的影响，同时收集培养细胞上清用ELISA检测诱导的iTregs分泌的功能相关细胞因子IL-10和TGF-β等。2、收集临床标本，流式细胞术检测外周CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞比例以及ELISA检测血清中GDF-15浓度，进而分析两者相关性；3、GDF-15在iTregs分化中的分子作用机制研究。利用激光共聚焦实验观察GDF-15在Na
ve CD4~+T细胞膜表面的表达情况，进一步用TGF-β受体阻断剂阻断后，Real-time PCR检测相关基因的转录水平。 结果：第一部分GDF-15诱导iTregs分化及其功能的鉴定的实验结果显示GDF-15能诱导Na 哪里 ve CD4~+T细胞向iTregs表型分化，且在GDF-15浓度为10ng/mL诱导5天时Foxp3的表达量最高，Real-time
GPCR Compound Library体内 PCR和流式细胞术显示iTregs的相关功能分子如Foxp3、CD25、GITR和CD103均表达升高。在进行相关功能检测中，Real-time PCR和ELISA实验显示iTregs可以分泌功能相关的抑制性细胞因子IL-10和TGF-β，BrdU掺入和CFSE实验结果进一步证实诱导的iTregs具有抑制效应CD4~+T细胞增殖的作用。第二部分临床实验通过SPSS13.0分析表明结直肠癌患者外周CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞与血清中GDF-15表达水平两者之间具有良好的相关性，相关系数达到0.7909。第三部分GDF-15在iTregs分化中的分子作用机制的实验中，通过激光共聚焦检测发现，GDF-15在Na ve CD4~+T细胞膜表面存在定位现象，Real-time PCR结果显示TGF-β受体阻断剂SB431542可以抑制GDF-15诱导Na ve CD4~+T分化过程中Foxp3的表达。 结论：GDF-15可以在体外诱导Na ve CD4~+T细胞向调节性T细胞方向分化，同时表现出天然调节性T细胞的表型和抑制功能；临床上结直肠癌患者外周CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞与血清中GDF-15表达水平表现出良好的相关性；初步确认了GDF-15可以在Na ve CD4~+T细胞表面存在定位现象，提示Na ve CD4~+T表面可能有GDF-15受体的存在。
目的：探讨TGF-β1/Smad信号通路在食管鳞癌上皮-间质转化（EMT）的作用及其机制；在细胞学实验的基础上探讨TGF-β1/Smad信号通路蛋白和EMT相关蛋白在哈萨克族食管鳞癌中的表达，分析其与临床病理特征的关系，为深入研究TGF-β1/Smad信号通路调控哈萨克族食管癌EMT的发生发展作用机制奠定基础，为食管癌浸润转移的阻断治疗提供理论基础。 方法：用不同浓度的重组TGF-β1刺激及TGFβ受体抑制剂SB431542抑制处理食管癌细胞Eca109，采用Western Blot方法检测TGF-β1/Smad通路和EMT相关蛋白表达水平；Transwell侵袭实验检测侵袭和迁移能力；进一步运用免疫组化检测100例食管鳞癌组织和58例癌旁非癌组织构成的组织芯片，研究TGF-β1/Smad信号和EMT相关蛋白的表达，分析TGF-β1/Smad和EMT相关蛋白与临床病理参数的关系。 结果： TGF-β1处理Eca109细胞，可以诱导细胞发生EMT形态改变，并且增强细胞侵袭能力，Western Blot检测发现N-cadherin、Vimentin、Smad2/3和Smad4蛋白表达显著上调，但Smad7蛋白表达下调；而SB431542处理细胞，结果显示：Vimentin、Smad2/3和Smad4蛋白表达水平下调，Smad7蛋白表达水平上调；免疫组化检测哈萨克族食管鳞癌组织中TGF-β1、p-Smad2/3、N-cadherin和Vimentin蛋白表达明显高于癌旁组织中的表达（p＜0.001），E-cadherin蛋白在食管鳞癌组织中的表达低于癌旁组织中的表达（p＜0.