7凋亡中的作用以及相关的分子机制。研究内容包括三个部分：一、观察TGF-β1在巨噬细胞RAW264.7凋亡中的作用和对TLR4受体表达的影响；二、观察TAK1在TGF-β1诱导巨噬细胞RAW264.7凋亡中的作用；三、探讨TAK1介导TGF-β1诱导巨噬细胞RAW264.7凋亡的相关分子机制。
研究方法与结果： 本课题实验分三部分进行： 第一部分应用流式细胞术检测TGF-β1刺激对巨噬细胞RAW264.7凋亡的影响,包括以下两个实验： 1、分别用5ng/ml、10ng/ml TGF-β1刺激巨噬细胞12小时,流式细胞仪检测巨噬细胞RAW264.7凋亡情况,结果显示TGF-β1具有诱导巨噬细胞RAW264.7凋亡的作用,且这种作用具有剂量依赖性； 2、流式细胞术检测TGF-β1刺激对巨噬细胞RAW264.7TLR4表达的影响,这部分实验分组如下：对照组,LPS组、TGF-β1组、LPS与TGF-β1联合刺激组、anti-TGF-β1中和抗体组,以及LPS与anti-TGF-β1中和抗体联合刺激组,检测结果显示,单独LPS、TGF-β1均能诱导巨噬细胞TLR4表达下降,并且者联合刺激时效应增强,LPS与anti-TGF-β1联合刺激和LPS单独刺激时相比,TLR4表达无明显变化,说明LPS与外源性TGF-β1具有协同抑制TLR4表达的作用。 第二部分利用电转染的方法在巨噬细胞RAW264.7中过表达TAKl,流式细胞术检测TAK1对TGF-β1诱导巨噬细胞凋亡的影响,包括以下两个实验： 确认细节 1、分别电转染10μg、15μg空质粒CMV、野生型质粒TAK1以及TAK1突变体TAK1K63W,60h后用lOng/ml TGF-β1刺激巨噬细胞30min,流式细胞术检测巨噬细胞RAW264.7凋亡情况,结果显示：与空质粒CMV、TAK1突变体TAK1K63W相比,TAK1具有明显抑制TGF-β1诱导巨噬细胞凋亡的作用,以10μg
TAK1抑制凋亡效应最明显。 2、检测TAK1在TAB1作用下对TGF-β1诱导巨噬细胞细胞凋亡的影响,实验分组如下：Empty plasmid组、TAB1组、TAKl组、TAK1与TAB1共转染组、TAK1K63W组、TAK1K63W与TAB1共转染组,结果显示TAK1具有抑制TGF-β1诱导巨噬细胞细胞凋亡的作用,并且在与TAB1共转染时,TAKl抗凋亡效应进一步增强。 第三部分探讨TAK1抑制TGF-β1诱导巨噬细胞凋亡的分子机制,包括以下两个实验： 1.TAKl对TGF-β1介导的巨噬细胞分泌TNF-α、IL-10等细胞因子的影响,实验分组如前,转染相应质粒入巨噬细胞,60h后,10ng/ml 此网站 TGF-β1刺激巨噬细胞24小时,ELISA检测炎性细胞因子TNF-α、IL-10,结果显示：与对照组相比,TAK1、TAK1与TAB1共转染组在TGF-β1刺激后TNF-α分泌减少,各转染组IL-10分泌与对照组相比无明显差异。 2.检测TAK1对TGF-β1介导的巨噬细胞凋亡相关分子的影响：实验分组如前,转染相应质粒入巨噬细胞,60h后,10ng/ml TGF-β1刺激巨噬细胞,提取蛋白,Western blot检测巨噬细胞中caspase-3活化情况,结果显示,对照组在TGF-β1刺激时,caspase-3明显活化,过表达TAK1后caspase-3活化受抑制。 结论： 1、TGF-β1具有诱导巨噬细胞RAW264.7凋亡的作用,且这种作用呈剂量依赖性；TGF-β1具有抑制巨噬细胞TLR4表达的作用。 2、在巨噬细胞RAW264.7中过表达TAK1能抑制TGF-β1诱导的巨噬细胞凋亡效应,TAB1具有促进TAK1抗凋亡效应的作用。 3、TAKl抑制TGF-β1介导的巨噬细胞的凋亡与TGF-β1刺激巨噬细胞分泌TNF-α相关,与IL-10无明显相关性；其凋亡信号传导与抑制caspase-3活化相关。
乙型脑炎(Japanese encephalitis, JE)是由日本乙型脑炎病毒(Japanese
encephalitis virus, JEV)引起的一种人畜共患病,患者多表现为发热、腹泻、头痛、恶心、意识水平下降、颤抖以及行动异常等,而猪群受感染后表现为明显生殖障碍。靶向中枢神经系统,引发中枢神经系统炎症反应,是乙型脑炎病毒导致人和动物发病、、死亡的主要因素。而小胶质细胞过度激活及其诱导的大量炎症因子分泌,则是JEV引发脑部炎症反应的重要途径。但JEV通过何种信号通路激活小胶质细胞,其分子机制如何等科学问题仍不清楚。 不 本研究首先从TLR3和RIG-Ⅰ信号通路入手,研究了JEV感染小鼠小胶质细胞之后炎症因子的表达、信号通路的激活情况。 具体研究内容如下： 以小鼠小胶质细胞系BV-2为体外模型,研究了乙型脑炎病毒在该细胞中的增殖情况,发现该病毒可以感染BV-2,但在该细胞中的增殖滴度较低,荧光定量检测C基因拷贝数在48h内增加不超过10倍。经荧光定量PCR与ELISA方法检测,乙型脑炎病毒感染能有效刺激细胞因子、趋化因子如TNF-α、IL-6、CCL-2表达量显著上调；同时,Western Blot检测结果显示TLR3、RIG-Ⅰ蛋白表达量因乙脑病毒刺激表现明显上调,且该病毒刺激能诱导信号通路激酶ERK、p38MAPK磷酸化蛋白及转录因子NF-κB、AP-1的核内表达量均显著上调。通过shRNA转染方法分别对TLR3和RIG-Ⅰ进行干扰,观察干扰后上述指标的变化,发现：ERK、p38MAPK蛋白磷酸化、转录因子NF-κB、AP-1的核内表达以及炎症因子表达均受到了不同程度的抑制,且细胞内病毒含量增加。表明TLR3与RIG-Ⅰ在乙脑病毒诱导小胶质细胞炎症反应与病毒增殖过程中起到了重要作用,且RIG-Ⅰ较TLR3更显著。
奶牛乳腺炎是世界范围内影响奶牛业最大的疾病。在众多能引起奶牛乳腺炎的病原中,S.