2±0.6)%和(23.9±0.5)%,套锁纤维舒张百分率高于钩状纤维(t=6.05, P=0.026);(2)促胰液素抗血清可分别阻断促胰液素对套锁纤维和钩状纤维舒张效应,细胞舒张百分数分别为(7.5±0.9)% (t=40.2, P=0.001)和(11.2±1.0)%(t=21.6, P=0.002),两者比较差异有显著性(t=6.39, P=0.024);腺苷酸环化酶激动剂Forskolin分别增强促胰液素对套锁纤维和钩状纤维舒张效应,细胞舒张百分数分别为(40.0±2.3)%(t=4.8, P=0.041)和(30.7±1.8)%(t=4.7, P=0.040);cAMP抑制剂分别阻断促胰液素对套锁纤维和钩状纤维舒张效应,细胞舒张百分数分别为(17.2±1.8)%(t=5.14,

P=0.036)和(14.7±4.3)%(t=4.76, P=0.041);(3)促胰液素使套索纤维与钩状纤维[35S]GTPγS结合率明显升高(52.8±19.5)%(t=3.33, P=0.029)和(44.9±20.9)%(t=3.23, P=0.032),两者比较无明显差异(t=0.83, P=0.455);(4) Gαs抗体可明显抑制促胰液素对套锁纤维和钩状纤维的舒张效应,细胞舒张百分数分别为(9.9±2.33)%(t=7.78, P=0.016)和(8.7±1.9)%(t=4.38, P=0.048);Gαi3和Gαq/11抗体对促胰液素引起套锁纤维舒张效应无明显影响,细胞舒张百分数分别(27.7±4.5)%(t=0.36, P=0.753)和(28.2±2.0)%(t=0.65,

P=0.582);对钩状纤维亦无明显影响,细胞舒张百分数分别为(22.6±1.2)%(t=0.718, P=0.547)和(21.5±4.6)%(t=0.758, P=0.528)。表明与促胰液素耦联的G蛋白类型是Gαs蛋白。 结论:促胰液素受体在人LES套锁纤维和钩状纤维均有表达;促胰液素引起套锁纤维和钩状纤维舒张的规律明显不同,套锁纤维舒张反应强于钩状纤维。部分说明介导促胰液素引起套锁纤维和钩状纤维舒张的信号转导通路为: 那个 因为 Gαs蛋白耦联于腺苷酸环化酶,催化三磷酸腺苷生成环一磷酸腺苷,后者参与平滑肌细胞的舒张。
钩端螺旋体(简称钩体)病是由致病性问号钩体(Leptospira interrogans)感染引起的全球性人兽共患病,也是洪涝、地震等自然灾害中重点的防疫和监控的传染病之一。问号钩体可直接经人或动物皮肤或黏膜迅速侵入宿主体内,随着血流播散至各脏器进行繁殖并导致病变,以黄疸、出血、肾衰竭为其典型的临床症状。迄今为止,尚未发现问号钩体能产生外毒素,已报道的一些细胞毒性因子和弱毒性的内毒素样物质难以解释问号钩体感染所致的病理改变,故其致病机制至今不明。 细胞凋亡是一种主动的、高度有序的死亡过程,涉及一系列基因和蛋白质的参与,其中caspase家族蛋白、MAPK家族蛋白等在凋亡的信号传导中扮演着极其重要的角色。业已发现,许多病原微生物能够诱导宿主细胞凋亡,并以此影响疾病的发生发展进程。有研究表明问号钩体可诱导体外培养的单核-巨噬样细胞凋亡,在豚鼠体内可引起肝细胞凋亡,但其诱导凋亡机制尚不明了。由于诱导宿主细胞凋亡不仅可能与问号钩体毒力有关,还可能涉及问号钩体免疫逃避及宿主体内生存,故深入了解问号钩体诱导细胞凋亡机制对于阐明其致病性有重要意义。 研究目的:探讨问号钩体感染对不同类型宿主细胞的影响及其诱导宿主细胞凋亡的信号传导机制,以期为钩端螺旋体病致病机制的阐明提供实验依据。 研究方法:采用乳酸脱氢酶(LDH)释放法,检测钩端螺旋体对不同细胞的毒性作用;采用流式细胞术(Annexin V/PI双染法)定量检测问号钩体感染对不同细胞凋亡和坏死的诱导作用;透射电子显微镜观察问号钩体诱导J774A.1和小鼠腹腔巨噬细胞凋亡的形态学变化;采用caspase荧光底物和荧光分光光度计检测问号钩体感染的J774A.1和小鼠腹腔巨噬细胞中caspase的活性变化;western blot法检测问号钩体感染对J774A.1和小鼠腹腔巨噬细胞中PARP、Lamin

Natural产品 Library A/C的裂解及FADD表达的影响;酶联免疫法(ELISA)检测问号钩体感染的J774A.1细胞中JNK和p38MAPK的磷酸化激活情况;应用caspase广谱或特异性抑制剂结合流式细胞术、荧光分光光度计、western blot法,检测这些抑制剂对问号钩体诱导的细胞凋亡和caspase信号传导系统的抑制作用;应用JNK和p38MAPK特异性抑制剂结合流式细胞术、荧光分光光度计、western blot法,检测JNK和p38MAPK在问号钩体诱导J774A.1细胞凋亡中的作用。 结果:(1)问号钩体感染抑制J774A.1、A549和小鼠腹腔巨噬细胞的细胞活性,具有浓度和时间依赖性。问号钩体感染对人脐静脉内皮细胞(EVC304和EVC-EC-C)没有细胞毒性作用。(2)问号钩体诱导J774A.1和小鼠腹腔巨噬细胞凋亡,具有浓度和时间依赖性。与J774A.1细胞相比,小鼠腹腔巨噬细胞对问号钩体的凋亡诱导作用更加敏感。问号钩体以时间依赖方式诱导A549细胞发生坏死,而对人脐静脉内皮细胞(EVC304和EVC-EC-C)无细胞凋亡或坏死诱导作用。(3)Caspase家族抑制剂(Z-VAD-fmk)以剂量依赖方式抑制问号钩体诱导的J774A.1和小鼠腹腔巨噬细胞凋亡。(4)问号钩体诱导J774A.1和小鼠腹腔巨噬细胞内caspase-3、-6、-8、-9的活化、caspase-3、-6底物PARP、Lamin A/C的裂解及FADD蛋白表达上调,并呈时间依赖性效应。(5)Caspase-8抑制剂可以抑制效应caspase-3、-6的活化及其底物的裂解,并进而抑制细胞凋亡,caspase-9抑制剂则对效应caspase-3、-6的活化、caspase-3、-6底物的裂解及细胞凋亡均无抑制作用,说明caspase-8作为启始caspase介导了问号钩体诱导的J774A.1和小鼠腹腔巨噬细胞凋亡,caspase-9可能通过caspase-3的反馈机制而激活,线粒体细胞色素c-caspase-9途径不参与问号钩体诱导的J774A.