为解决这些问题，文中提出一种对SpCas9的定向进化突变体xCas9进行优化的理性方法。首先，使用Rosetta程序进行能量最小化以优化Cas9的三维结构，获得其能量最低的构象；然后，对其定向进化所得氨基酸位点进行组合突变设计；最后，通过自由能排序从设计突变体中筛选出用于实验验证的最优变体。经DNA剪切实验验证，成功地获得了一个多PAM识别和低点击此处脱靶的新变体yCas9 (262A/324R/409N/480K/543D/694L/1219T)。该变体可识别NG、GAA和GAT序列，且其由错配sgRNA引导的脱靶DNA剪切活性低，为生物医学领域提供了一个有潜在应用价值的基因编辑工具。同时，文中还对SpCas9、xCas9和yCas9进行了分子动力学模拟，揭示了其一般PAM识别和脱靶效应的机理，可为进一步的CRISPR/Cas9蛋白优化改造提供理论指导。
原发性家族性脑钙化症(primary familial brain calcification, PFBC)是慢性进展性的神经系统遗传病,临床症状主要包括运动障碍、认知障碍及精神障碍等,其致病机制尚未完全明确。研究表明SLXH254LC20A2是该病最主要的致病基因。由于Slc20a2基因全身性敲除小鼠模型会导致胎儿生长受限,为更好地研究PFBC发病机制,本研究应用CRISPR/Cas9技术构建了纹状体Slc20a2基因条件性敲除小鼠模型。首先,针对Slc20a2基因编码区,设计3条靶向exon3的sgRNA (single guide RNA),通过构建质粒、转染细胞、Surveyor assay等实验验证sgRNA的活性。