给予GSK3β的特异性阻断剂SB216763（2*10-5M）与RSG（10-6M）共同处理成骨细胞。SB216763能完全逆转RSG对成骨细胞增殖的抑制效应。提示，RSG抑制成骨细胞的增殖也是通过激活GSK3β实现的。 3.进一步探讨RSG抑制增殖作用的受体机制，联合使用PPARγ特异性阻断剂GW9662（10-6M）与RSG（10-6M），结果GW9662不能阻断RSG抑制成骨细胞增殖的作用。进一步利用siRNA干扰技术，敲低细胞内的PPARγ，RSG抑制增殖的效应仍然存在，提示RSG抑制成骨细胞增殖的作用不依赖于PPARγ。

4.为明确RSG是否通过GPR40来抑制成骨细胞的增殖，我们利用siRNA技术，敲低细胞内GPR40，再用RSG处理细胞，结果发现，RSG抑制成骨细胞增值的作用被完全逆转了。这提示，RSG是通过GPR40发挥抑制成骨细胞增殖的效应。 5.我们也观察了SHP-1在成骨细胞增殖中的作用。利用siRNA技术敲低细胞内的SHP-1，成骨细胞的增殖显著降低。提示SHP-1对成骨细胞的增殖具有正向调节作用。 二、异黄酮类植物雌激素对ERE和CRE转录活性的调节 （一）异黄酮类植物雌激素对ERE转录活性的调节 1、利用脂质体瞬时转染的方法，在MG63细胞上分别过表达ERα和ERβ，给与不同浓度的雌激素和植物雌激素（大豆甙元、染料木素、葛根素、山萘酚、槲皮素）处理，结果发现，在过表达ERα时，E2在10-10～10-8M，都能显著促进ERE报告基因的转录；大豆甙元和染料木素在高浓度（10-6M，10-7M）对ERE报告基因的转录有较强的促进作用；其他植物雌激素，除山萘酚在高浓度时（10-6M）有微弱的促进作用外，对报告基因的转录均没有调节作用。 BYL719分子重量 过表达ERβ后，除山萘酚和槲皮素的作用与过表达ERα的结果相同外，雌激素和其余的植物雌激素均对报告基因的转录有调节作用。E2从10-9～10-6M，都能显著促进ERE报告基因的转录；大豆甙元以及染料木素对ERE报告基因的转录促进作用均较过表达ERα时的效应显著。而葛根素（10-10～10-6M）对报告基因的转录呈现出非浓度依赖的抑制作用。 2、进一步观察雌激素受体完全拮抗剂ICI182,780以及选择性雌激素受体拮抗剂4-OH-tamoxifen通过不同的ER亚型对ERE报告基因的转录调节作用。将ERα或ERβ与ERE报告基因共转染后，给与ICI182，780或4-OH-tamoxifen处理。ICI182,780仅在过表达ERβ时，对报告基因表现出剂量依赖性的转录抑制效应；4-OH-tamoxifen通过不同的ER亚型，对报告基因的转录调节作用也不同：过表达ERα时，呈现出剂量依赖性的转录促进作用；而过表达ERβ时，则表现出非剂量依赖性的转录抑制效应。

3、将雌激素或植物雌激素与雌激素受体拮抗剂联合使用，观察在过表达不同的雌激素受体亚型后，雌激素或植物雌激素对报告基因的调节作用是否发生改变。结果发现，当过表达ERα时，给与ICI182,780或4-OH-Tam联合作用，雌激素的转录调节作用几乎被完全阻断，大豆甙元和染料木素对报告基因的转录调节作用被部分阻断，而山萘酚的转录调节作用则不受影响。 过表达ERβ时，雌激素，大豆甙元，染料木素以及山萘酚对报告基因的转录调节作用几乎被完全阻断，葛根素对报告基因的转录调节作用则不受影响。由于葛根素表现出拟ERβ拮抗剂样作用，所以当葛根素与雌激素或其他植物雌激素联合使用时，雌激素，大豆甙元，染料木素和山萘酚对报告基因的转录调节作用都能被部分阻断。 （二）异黄酮类植物雌激素对CRE转录活性的调节 1.由于雌激素还具有ERE非依赖的作用机制，我们前期的实验也证明，雌激素对CRE基因具有转录抑制作用。为明确大豆异黄酮是否也具有这样的作用，我们将CRE报告基因转染入MG63细胞中，分别给与不同浓度的雌激素，染料木素和大豆甙元处理。雌激素对CRE报告基因的转录有抑制作用，且具有剂量依赖性。染料木素和大豆甙元都在高浓度时（10-6M），对CRE报告基因具有转录抑制作用。但均不能促进CREB的磷酸化。 PLX3397 外源性给予CRE的激动剂8-Br-cAMP，能促进CRE报告基因的转录活性，而雌激素和染料木素能去除8-Br-cAMP对报告基因的促转录效应，大豆甙元则没有此作用。 2.为进一步确定大豆甙元和染料木素在MG63细胞上，对CRE的转录调节作用是否和雌激素的作用相似，我们观察了他们对MG63细胞上的SGK1和IL-8的mRNA表达的影响。这两个基因的启动子区域都含有CRE-like的序列。结果发现，雌激素，染料木素对SGK1和IL8mRNA的表达都有抑制作用，而大豆甙元仅对IL8的mRNA表达有抑制作用。 进一步用8-Br-cAMP诱导，使SGK1和IL8的mRNA的表达增加，再给予雌激素、染料木素和大豆甙元作用，结果也与未使用8-Br-cAMP诱导时的相一致。以上结果都提示大豆甙元和染料木素都具有雌激素样作用，即可以通过调节启动子中含有CRE like的靶基因的转录活性，发挥调节基因转录的效应。并且染料木素和大豆甙元对于不同的基因，调节转录的机制可能也有所不同。

3.为确定ERs的两类亚型在大豆异黄酮物质的上述转录调节作用中分别起何作用。我们将ERα和β分别与CRE报告基因共转染后，给予雌激素和大豆异黄酮作用，观察药物对报告基因转录活性的影响。 将ERα和CRE报告基因共转染后，雌激素和两种大豆异黄酮物质都能剂量依赖性的抑制CRE报告基因的转录活性。再分别给予雌激素受体拮抗剂ICI182780和选择性雌激素受体调节剂4-OH-tamoxifen,以及ERα特异性受体拮抗剂MPP作用。ICI182780和MPP本身通过ERα都能够促进CRE报告基因的转录活性，4-OH-tamoxifen通过ERα则没有转录调节作用；但是，三种药物分别与雌激素和大豆异黄酮共同作用时，都能够逆转雌激素和大豆异黄酮对CRE报告基因的转录抑制作用。 也许 将ERβ和CRE报告基因共转染后，雌激素对报告基因的转录抑制作用消失了，大豆甙元和染料木素仍然能够抑制CRE报告基因的转录活性，但是缺乏剂量依赖性。使用ICI182780，4-OH-tamoxifen,以及ERβ特异性受体拮抗剂THC作用后，三种药物通过ERβ对CRE报告基因的转录活性都没有影响；但与大豆甙元和染料木素联合使用后，都能够逆转大豆甙元和染料木素通过ERβ对报告基因的转录抑制作用。 结论： 1. RSG显著抑制颅骨来源的成骨细胞的分化，SHP-1对成骨细胞的分化具有促进作用。两者的作用都是通过改变GSK3β的活性实现的。RSG通过激活GSK3β，促进其磷酸化，进而抑制β-catenin的表达；SHP-1则通过抑制GSK3β的活化，来促进分化。RSG抑制成骨细胞中SHP-1的mRNA表达。RSG抑制成骨细胞分化的作用仅部分依赖于PPARγ；同时，GPR40在诱导成骨细胞分化过程中维持低表达，RSG可促进GPR40表达，后者由此介导了部分RSG作用。 2.