1mg/ml浓度负荷的颗粒共同培养,Western-blot法和免疫荧光检测磷酸化p38的蛋白表达水平,同时检测MMP-2 mRNA的表达情况。 结果钛颗粒增加MC3T3-E1细胞MMP-2 mRNA和磷酸化p38蛋白的表达水平。不同的颗粒负荷组别间MMP-2 mRNA表达水平存在显著差异(F=295.097, P=0.000)。各时间点的表达水平也存在差异(F=23.757, P=0.000)。Western-blot法和免疫荧光检测显示磷酸化p38蛋白水平在第1、3天分别升高1.5倍和1.25倍。应用特异性阻断剂后,钛颗粒诱导的磷酸化p38蛋白水平升高和MMP-2 mRNA水平升高的效应完全被抑制。 结论钛颗粒通过p38丝裂原活化蛋白激酶信号在转录水平诱导成骨细胞MMP-2表达增多。
研究目的： 硼替佐米(万珂,Bortezomib/velcade)是一种二肽硼酸衍生物,是第一个由美国食品药物管理局(FDA)批准上市的蛋白酶体抑制剂,对多发性骨髓瘤的治疗具有较高的总体有效率和完全缓解率。Bortezomib抗瘤谱广,研究表明Bortezomib能诱导急性髓性白血病细胞(AML)发生凋亡,且单药或联合其他化疗药物治疗白血病均具有一定的临床疗效,但其作用机制阐释尚不明确。随着对细胞分化异常在恶性肿瘤发病学和治疗学上的意义认识的日益加深,肿瘤的分化治疗成为当今肿瘤学研究的热点之一。其中,全反式维甲酸(ATRA)诱导分化治疗急性早幼粒白血病(M3,

Epigenetics抑制剂 APL)疗法,已列为诱导缓解APL的首选方案之一,但ATRA耐药、严重毒副反应以及复发等仍是当前迫切需要解决的问题。因此,寻找高效低毒的新型分化诱导剂或寻找有效的药物联用方案是解决上述问题的关键途径。 基于此,本研究探讨了Bortezomib单药或联合ATRA在诱导分化治疗AML中的药效及其作用机制。研究内容主要包含了两个部分：(1)

Bortezomib对急性髓性白血病细胞的诱导分化作用及其作用机制研究；(2) Bortezomib联合ATRA对急性髓性白血病的协同治疗作用,并探究了维甲酸受体RARα通路在该过程中所发挥的作用。 研究方法： 1)选用人白血病细胞株HL60和U937为主要研究对象,人原代急性髓性白血病细胞为辅助研究对象,考察了Bortezomib对AML细胞的分化诱导作用：采用台盼蓝染色结合血细胞计数板计数观察细胞增殖情况,描绘细胞增殖曲线；应用吉姆萨染色观察细胞形态学改变；采用硝基四氮唑蓝(NBT)测试细胞还原能力；细胞经CD14-FITC或CD11b-PE抗体孵育后采用流式细胞术检测细胞表面分化抗原CD14或CD11b表达；应用Western Selleck BI6727 blotting检测MAPK家族蛋白表达及活化水平(p-MEK、p-ERK、p-JNK、p-p38、MEK、JNK2、p38),检测分化启动因子STAT1表达及活性水平(p-STAT1 Try701、STAT1);应用Realtime

PCR检测细胞STAT1 mRNA表达水平,并利用CHX抑制蛋白合成研究Bortezomib引起的STAT1蛋白上调的原因；用携带shRNA-STAT1的慢病毒载体转染HL60细胞,通过沉默STAT1研究其在Bortezomib诱导的AML细胞分化中的关系。利用MEK特异性抑制剂PD98059、JNK特异性抑制剂SP600125和p38抑制剂SB203580研究MAPK通路在Bortezomib诱导的AML细胞分化中的关系；采用Annexin 更多 V-FITC/PI染色结合流式细胞术测定Bortezomib对AML细胞的凋亡率及初步探讨Bortezomib诱导的细胞分化与凋亡的关系。 2)选用人白血病细胞株HL60和NB4为主要研究对象,人原代急性髓性白血病细胞为辅助研究对象,考察Bortezomib与ATRA对AML细胞的联合治疗作用：采用台盼蓝染色结合血细胞计数板计数观察细胞增殖情况和细胞存活率,描绘细胞增殖曲线；应用吉姆萨染色观察细胞形态学改变；采用硝基四氮唑蓝(NBT)测试细胞还原能力；细胞经CD11b-PE抗体孵育后采用流式细胞术检测细胞表面分化抗原CDllb表达；采用HL60细胞裸小鼠移植瘤模型考察Bortezomib与ATRA在体内的联合治疗作用；采用免疫组化法检测瘤组织切片C/EBPε的蛋白表达含量；采用TUNEL法考察瘤组织切片中凋亡情况；应用Western blotting检测RARα蛋白表达情况,检测相关分化转录因子的表达(p-STAT1 Try701、STAT1、c-Myc、C/EBPε、p-27),检测MAPK家族蛋白表达情况(p-MEK、p-JNK);应用Realtime PCR检测细胞RARα、STAT1 mRNA表达水平；采用免疫荧光法检测p65和STAT1在细胞内的定位；采用非放射性凝胶迁移法检测STAT1与DNA的结合能力；用慢病毒介导的STAT1 shRNA转染HL60细胞,通过沉默STAT1研究其在Bortezomib与ATRA联用治疗AML中的作用。 研究结果： 第一部分：Bortezomib通过上调MEK/ERK-JNK p46通路活性,激活STAT1从而诱导AML细胞向单核/巨噬系细胞分化。 1) Bortezomib具有诱导人急性髓性白血病细胞向单核/巨噬系细胞分化成熟的能力。 用细胞增殖抑制率、细胞形态学、生化指标、分子标志等指标观察Bortezomib对AML细胞的诱导分化成熟能力。结果显示Bortezomib (5 nM)能诱导人急性髓性白血病(AML)细胞向单核／巨噬系细胞分化。Bortezomib (5 nM)可显著抑制HL60和U937细胞增殖,第3天的抑制率分别为44.6%和60.